酶底物法與多管發酵法測定水中糞大腸菌群的對比研究

范秀英，黃俊蘭

（四川省攀枝花生態環境監測中心站，四川 攀枝花 617000）

糞大腸菌群[1]是總大腸菌群中的一部分，是一群能在一定溫度（44.5±0.5 ℃）下生長并發酵乳糖、產酸產氣且能產生β-半乳糖苷酶的大腸菌群，又稱耐熱大腸菌群。水中糞大腸菌群的檢測方法主要有傳統的多管發酵法[2]和濾膜法，以及近幾年列入環保行業標準方法的酶底物法[3-5]。多管發酵法需要的試劑和器材比較多，分析步驟多，檢測周期長，培養基保存時間短，陽性結果還需復發酵試驗，需檢測人員花費大量的時間，不能快速判斷樣品的污染狀況，不適用于應急和樣品量較大時檢測使用。

酶底物法彌補了多管發酵法的不足，是現代微生物快速檢測的發展方向[6]。因此，本文采用酶底物法與多管發酵法分別測定大量不同水樣中糞大腸菌群，通過多方面比較兩種方法的優缺點。

1 實驗部分

1.1 設備和材料

酶底物法：培養基（科立得TM（Colilert）試劑），恒溫培養箱（44.5±0.5 ℃），100 mL無菌瓶（含有1.5%的硫代硫酸鈉），程控封口機，高溫滅菌器，97孔定量盤，購置的或經過121 ℃、30 min高溫滅菌后的無菌水，97孔標準陽性比色盤等。

多管發酵法：高溫滅菌器，單倍和三倍乳糖蛋白胨培養基，EC肉湯培養基，3 mm接種環，酒精燈，移液槍，恒溫培養箱（控溫精確±0.5 ℃）、恒溫振蕩水浴鍋等。

2 實驗步驟

2.1 多管發酵法

2.1.1 初發酵實驗

將水樣充分搖勻，根據水樣受污染的程度來確定水樣的接種量。

將水樣進行1：10的稀釋。相對干凈的水樣，在5個裝有5 mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養基的試管中（內有小倒管）各加入10 mL水樣；在5個裝有10 mL乳糖蛋白胨培養基的試管中（內有小倒管）各加入1 mL水樣；在5個裝有10 mL乳糖蛋白胨培養基的試管中（內有小倒管）各加入1 mL 1：10稀釋的水樣；將各管充分混勻，置于37±0.5 ℃恒溫培養24±2 h。

受污染的水樣接種量可以接種1 mL、0.1 mL、0.01 mL。通過產酸和產氣來判斷發酵管試驗的陽性結果。如在倒管內產氣現象不夠明顯，可以輕拍試管，根據試管內是否有小氣泡升起來判斷是否為陽性，有則判斷為陽性。

2.1.2 復發酵實驗

初發酵試驗確認是陽性或者疑似陽性的樣品管還需通過復發酵實驗驗證。將轉接后的試驗管在30分鐘內放入水浴中，并在44.5±0.5 ℃下培養24±2 h，再觀察發酵管的產氣情況，如產氣則證明該管試驗為陽性。

2.2 酶底物法

酶底物法：將水樣充分搖勻，根據樣品受污染的程度來確定水樣的接種量。盡量避免接種樣品培養后97孔定量盤全部為陽性或全部為陰性的情況。

將科立得TM（Colilert R）試劑加入100 mL裝有相對干凈的水樣的取樣瓶中，待試劑完全溶解后，倒入無菌97孔定量盤中，用封口機封口后在培養箱中培養24 h。到達培養時間后取出，并與標準比色盤進行比較，根據標準比色盤進行判讀，記錄陽性的大小孔數。如果結果無法判斷，可延長培養時間到28 h后再進行判讀。將記錄的陽性大小孔數查對應的MPN值，乘以相關稀釋倍數從而得出樣品的MPN值。

若樣品量小于100 mL或者是受污染的水樣，需要將水樣稀釋。取10 mL的水樣加入已滅菌的90 mL無菌水中，制成1：10稀釋水樣，未知樣品可以多選用幾個接種量進行檢測。

3 實驗結果與比較

3.1 兩種測定方法實驗數據可行性比較

采用糞大腸菌群質控樣品MIC-DWCOL，210527，用無菌水活化，分別用兩種方法對質控樣進行分析，最終得出表1所示結果。結果表示，兩種方法的檢測結果均在質控要求范圍內。

表1 質控樣品的分析結果

3.2 兩種測定方法的比對分析

為了比較兩種方法在實際工作中的適用性，選取了攀枝花金沙江和雅礱江斷面地表水、地下水共40個樣品進行試驗，將水樣稀釋使其MPN值控制在20～2 400 MPN/100 mL之間，為了使兩組數據呈正態分布，先將數據進行對數處理，再運用SPSS 統計軟件，對兩種方法的結果進行配對t 檢驗，結果見表2。

表2 若干斷面兩方法比對結果

共采集40個水樣，分別用酶底物法和多管發酵法測定糞大腸桿菌，結果見圖1。

圖1 兩種方法的糞大腸桿菌測定結果

運用SPSS 17.0統計軟件，對酶底物法和多管發酵法做配對t檢驗分析，結果見表3。

表3 兩種結果的t檢驗結果

由表3可見，兩種方法的t=0.720，顯著性=0.474，表明二者相關性良好，兩種方法無顯著性差異。

在用兩種方法檢測糞大腸菌群時發現，酶底物法和多管發酵法檢測結果的相關性強，樣品濃度在低濃度范圍比高濃度范圍更好，但統計學意義上有點差異。在置信度95%的情況下差異是可被接受的，且滿足環境監測要求。

3.3 試驗環境對兩種方法分析結果的影響

多管發酵法對實驗室的環境要求很高，操作過程必須要求無菌環境，實驗室環境對結果影響很大。圖2是在6個不同點位采集的水樣，用酶底物分別在無菌實驗室、非無菌實驗室、室外環境中進行檢測的分析結果。由此可以得出，酶底物法與實驗環境是否無菌關系不大。

圖2 實驗環境對酶底物法的結果影響

3.4 培養溫度對兩種方法分析結果的影響

在6個不同的點位采集水樣，多管發酵在35～39 ℃進行培養，酶底物法在42～46 ℃進行培養，觀察培養溫度對兩種方法分析結果的影響。從實驗數據可以看出：多管發酵最佳培養溫度為37±0.5 ℃，但是在36～38之間培養結果的差異不是特別大；酶底物法檢測糞大腸菌群最佳培養溫度為44.5±0.5 ℃，如果溫度過高或過低都會對監測結果影響較大。因此，兩種分析方法中酶底物法更需嚴格控制培養溫度，使用的培養箱應有較低溫度波動和較好溫度均勻度。

表4 酶底物法在不同培養溫度下的分析結果

3.5 培養時間對酶底物法分析結果的影響

在不同的點位采集6個水樣，按酶底物方法將樣品在44.5±0.5 ℃的溫度下培養，不同時間后觀察培養結果。可以看出，在12 h以內樣品的顯色都不明顯，無法得出檢測結果，當時間達到20 h左右時，定量盤的顏色和陽性孔數會達到穩定。當繼續培養至28 h時，陽性孔數也基本不會再變化。所以酶底物法測定水中糞大腸菌群，20 h左右即可得檢測結果。結果見圖3。

圖3 酶底物法在不同培養時間下的分析結果

4 結論

應用酶底物法和傳統的多管發酵法檢測水中糞大腸菌群時，檢測結果在準確性方面無太大差異，而酶底物法檢測的靈敏度要高于多管發酵法。傳統的多管發酵法在操作方面比酶底物法更加繁瑣，且工作量大，對水樣保存時間和對實驗室環境要求更加嚴格，不適用于突發性環境污染事件監測對速度的要求；酶底物法采用的購買成品培養基及試劑，操作流程簡便，減少了部分實驗過程中可能受污染的環節，最快20 h左右即可判斷水樣中糞大腸菌群的MPN值，酶底物法較好地彌補了傳統方法的不足，之前進口試劑價格昂貴，會大幅增加檢測成本，但近年來國產酶底物試劑的質量已優化，做了多次比對后發現與進口試劑基本等效，所以購買國產試劑用于檢測，會解決成本高的問題。因此，綜合比較，酶底物法不僅適合常規實驗室分析，更適合應急突發環境事件中的現場檢測以及樣品量較大時水樣品中的微生物檢測。