高效液相色譜法測定1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑中 雜質3-甲基吡啶

吳艷嬌，張 鐸，李永娜，鄔美男

（北京思農源信息咨詢有限公司，北京通州 101149）

氯蟲苯甲酰胺是第一個具有新型鄰酰胺基苯甲酰胺類化學結構的廣譜殺蟲劑，由DuPont公司發現并開發。該劑的主要作用機制是激活昆蟲蘭尼堿受體，使昆蟲釋放平滑肌和橫紋肌細胞內貯存的鈣離子，使肌肉調節功能減弱、害蟲麻痹，甚至死亡[1]。此物質對鱗翅目、鞘翅目葉甲科、雙翅目潛蠅科、煙粉虱等多種害蟲的防治效果顯著，廣泛應用于煙草、水稻和果蔬的害蟲防治[2-3]。

3-甲基吡啶又稱3-皮考林，是重要的醫藥、化工原藥。歐盟登記規定了氯蟲苯甲酰胺原藥中3-甲基吡啶為相關雜質，其含量不能高于3 g/kg[4]。我國農業農村部2020年公布了相關雜質清單，其中將3-甲基吡啶列為氯蟲苯甲酰胺的相關雜質之一。

國內關于氯蟲苯甲酰胺的測定方法報道較多，而關于3-甲基吡啶的測定方法報道較少，目前國內文獻中僅有液相色譜法[5]。目前尚未見對氯蟲苯甲酰胺中3-甲基吡啶的檢測方法的相關報道。 本文建立了氯蟲苯甲酰胺制劑中3-甲基吡啶的液相色譜分析方法，滿足氯蟲苯甲酰胺系列產品質量控制和登記資料需求。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

KH-500型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；Aglient 1200型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器、四元低壓輸液泵、脫氣機和自動進樣器（美國安捷倫公司）。

1.2 試劑與材料

3-甲基吡啶（質量分數99.1 %，阿拉丁試劑上海有限公司）；冰乙酸（分析純，南京化學試劑廠）；磷酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙酸銨（色譜純，阿拉丁試劑上海有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia Company, Inc）；水為二次重蒸水；1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑由某農藥企業提供（氯蟲苯甲酰胺含量0.25%）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱為Zorbax EclpisePlus-C18柱 （250 mm × 4.6 mm ID, 5 μm），柱溫為30 ℃；流動相為乙腈/冰乙酸-乙酸銨水溶液（1 L水中加入3 g冰乙酸、3.85 g乙酸銨，超聲溶解，過0.45 μm濾膜），采用梯度洗脫程序（表1），流速為1.0 mL/min，檢測波長為262 nm，進樣量為10 μL。在該色譜條件下，3-甲基吡啶的保留時間約為5.5 min。

表1 流動相梯度條件

1.3.2 標準溶液的配制

標準溶液母液：準確稱取3-甲基吡啶標樣0.038 1 g （精確至0.000 2 g）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

標準溶液：移取1 mL標準母液，用甲醇稀釋至1 000 mL，得到3-甲基吡啶的質量濃度為0.38 mg/L。

1.3.3試樣溶液的制備

稱取粉碎的1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑試樣5.0 g （精確至0.000 2 g） 于150 mL錐形瓶中，準確加入100 mL甲醇，將樣品超聲5～10 min溶解完全后，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

1.3.4 測定

在上述色譜操作條件下，待儀器穩定后進2針標準溶液，待2針溶液的峰面積相對變化不大于10%，然后按標準溶液、試樣溶液、試樣溶液、標準溶液的順序依次進樣。

1.3.5 計算

將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中3-甲基吡啶的峰面積分別進行平均。試樣中3-甲基吡啶的質量分數X1（%）按式⑴計算：

式中：A1為標樣溶液中3-甲基吡啶的峰面積平均值；A2為試樣溶液中3-甲基吡啶的峰面積平均值；m1為標樣溶液中3-甲基吡啶的質量，g；m2為試樣的質量，g；w為標樣中3-甲基吡啶質量分數，%；1 000為標準溶液的稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

由于3-甲基吡啶呈弱酸性，為了使其峰形對稱且具有良好的分離度，本文分別采用了乙腈/0.04%磷酸水溶液（5/95，體積比）、乙腈/冰乙酸-乙酸銨水溶液（1 L水中加入3 g冰乙酸和3.85 g乙酸銨） （15/85，體積比）為流動相。

當采用乙腈和0.04%磷酸為流動相時，色譜峰形對稱，但保留時間較短，其后面的負峰對其準確定量有一定影響，典型標樣色譜圖見圖1A。當采用乙腈/冰乙酸-乙酸銨水溶液=15/85為流動相時，3-甲基吡啶的保留時間約為5.5 min，色譜峰形對稱，分離度良好，典型標樣和試樣色譜圖見1B和圖2。從圖1B和圖2可見，3-甲基吡啶附近無雜質干擾，能滿足3-甲基吡啶定量分析要求。

圖1 3-甲基吡啶標樣的色譜圖

圖2 試樣的色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

采集190～400 nm的光譜數據，從3D譜圖分析可知，3-甲基吡啶的最大吸收波長為262 nm，因此選擇262 nm作為檢測波長。在該波長下3-甲基吡啶的靈敏度最高，且無雜質干擾。

2.3 方法的線性關系

移取適量標準母液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到3.8 mg/L標準溶液。再用甲醇逐級稀釋，得到3-甲基吡啶質量濃度分別為0.095、0.19、0.38、0.76、3.8 mg/L的標準溶液。按1.3.1節色譜操作條件進行測定，每個濃度溶液重復測定3次。以標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標，繪制標準曲線（表2）。可見，3-甲基吡啶峰面積與其質量濃度之間表現出良好的線性關系。

表2 3-甲基吡啶的線性方程、線性范圍、相關系數

2.4 方法的定量限

在1.3.1節色譜條件下測定3-甲基吡啶標樣（0.095 mg/L）。選擇3-甲基吡啶色譜峰附近的一段基線作為噪聲，利用chemisation軟件進行信噪比分析。該濃度下，信噪比為16.9。因此10倍信噪比儀器的定量限為0.056 mg/L。按照1.3.3節中方法配制試樣溶液，方法的定量限為1.12 mg/kg。目前國內雖然公布了氯蟲苯甲酰胺中的相關雜質，但并未規定雜質限量。根據歐盟登記原藥中3-甲基吡啶的限量，含量為0.25%氯蟲苯甲酰胺的1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑中3-甲基吡啶的限量為7.8 mg/kg，方法定量限完全滿足3-甲基吡啶的定量要求。

2.5 樣品的測定

按1.3.2節配制1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑試樣溶液，分別平行制備5份試樣溶液。在1.3.1節色譜條件下檢測3-甲基吡啶含量，典型試樣色譜圖參見圖4。可以看出，所有試樣中均未檢出3-甲基吡啶。

圖4 試樣中3-甲基吡啶標樣的色譜圖（未檢出）

2.6 方法的準確度

采用添加法，稱量試樣5.0 g于150 mL錐形瓶中，加入1.0 mL 37.8 mg/L 3-甲基吡啶標準溶液，得到加標試樣含量為7.6 mg/kg，再準確加入99.0 mL甲醇，超聲5～10 min溶解后，冷卻至室溫后，過濾。平行制備5個樣品，在1.3.1節色譜條件下測定（表3）。可見，3-甲基吡啶的回收率為101.1%～106.6%，平均回收率104.9%，說明該方法的準確度滿足痕量組分定量要求。典型的加標試樣色譜見圖3。

圖3 3-甲基吡啶的3D光譜圖

表3 方法準確度試驗

3 結 論

利用反相高效液相色譜儀建立了一種梯度洗脫測定氯蟲苯甲酰胺中雜質3-甲基吡啶的方法。該方法回收率為101.1%～106.6%，所得回歸方程線性范圍寬（0.095～3.8 mg/L），相關性良好，方法定量限低（1.12 mg/kg），為生產企業的氯蟲苯甲酰胺系列產品注冊、生產過程質量控制和產品貿易提供了切實可行的分析檢測手段。