激光掃描共聚焦光譜系統設計

周旻超王振亞*王弼陡羅剛銀馬思齊

激光掃描共聚焦光譜系統設計

周旻超1，2，王振亞2*，王弼陡2，羅剛銀2，馬思齊2

（1.復旦大學 工程與應用技術研究院，上海 200433；2.中國科學院 蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇 蘇州 215163）

激光掃描共聚焦；Amici棱鏡；色散線性度；共光軸直視型

1 引言

激光掃描共聚焦顯微鏡成像光學分辨率介于傳統光學顯微鏡和電子顯微鏡之間，能夠實現高分辨率下的無損三維成像，把光學顯微成像技術推向了全新的應用階段，是國內外從事生物醫學和材料科學研究不可或缺的高端科研設備［1-2］。與傳統寬場顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡通過針孔濾波的方式，消除焦平面外雜散光的干擾，可實現光學層切掃描成像。

隨著生物醫學技術的迅速發展，對被測樣品進行多種熒光標記物標記的需求日益增高［3］。因此，多光譜成像技術得到了較為廣泛的應用。為了實現對生物樣本不同部位的成像，一般采用不同的熒光染料對樣本進行熒光標記，但有些熒光染料激發譜較寬容易和其他熒光染料激發譜重疊。為避免多種熒光成像時的熒光串擾問題，激光掃描共聚焦顯微系統引入了多光譜成像技術［4-5］。共聚焦實現光譜成像的主要方式有濾光片式、光柵式以及棱鏡式等，其中分光元件是光譜成像的核心部件［6-7］。濾光片式熒光分光組件的應用方便簡單，但它是固定的波長組合，很大程度上限制了熒光染料選擇的靈活性，很難解決熒光串擾問題。因此，光柵或棱鏡分光的方法被更多地應用于多光譜成像技術中。光柵分光具有色分辨率高、色散線性均勻等優點，但也有局限性，如光柵系統在寬譜段分光時，存在譜線疊加問題；制造工藝導致光柵分光的雜散光較多，加工難度較大；光柵是通過衍射分光，能量利用率只能達到總能量的60%～70%左右［8］。共聚焦成像熒光信號較為微弱，光譜衍射效率是十分重要的指標。棱鏡分光原理簡單，性能穩定，熒光透射效率高（一般大于90%），十分適合應用于共聚焦顯微鏡的光譜成像。共聚焦顯微鏡棱鏡式分光一般采用單棱鏡，由于棱鏡材料本身的性質，光譜分辨率存在非線性問題，短波段的色分辨率高，長波段的色分辨率低，因此不同波段的光譜分辨率也是不同的。除此之外，單棱鏡的色散會引起光線在傳播方向上的偏折，給光學裝調增加了一些難度。

復合棱鏡組合在設計方面具有更高的靈活性，在保證較高的能量利用率的同時，通過選擇棱鏡的材料以及控制各棱鏡的角度實現入射和出射光束共軸，以及色散的非線性校正［9］。共聚焦顯微鏡的模塊化研發需要考慮結構小型化、空間利用率高、裝調簡單等因素，本文采用雙Amici棱鏡結構作為色散元件，根據Amici棱鏡的光學特性推導其共軸條件，優化材料和棱鏡頂角實現了寬光譜、共光軸、直視型光譜分光系統，大大改善了棱鏡分光的非線性。

2 系統組成

激光掃描共聚焦顯微鏡主要由掃描模塊、顯微鏡和光譜成像模塊等部分組成，如圖1所示。掃描模塊中的激光進入顯微鏡后被物鏡聚焦在被測樣本上，激發出的熒光經顯微鏡進入掃描模塊，在二向色鏡處透射，再經針孔透鏡聚焦后通過針孔進入光譜成像模塊。光譜成像模塊由準直透鏡、分光棱鏡、聚焦透鏡、可變狹縫以及光電倍增管（Photomultiplier Tube， PMT）組成，熒光進入光譜成像模塊后先由準直透鏡準直成平行光，再進入分光棱鏡和聚焦透鏡，分光棱鏡將熒光展開成一定寬度的光譜帶，利用可調狹縫進行光譜選擇并由PMT采集信號。

圖1　共聚焦光譜系統組成

3 Amici結構建模及設計

本文從棱鏡的光學特性出發，根據光束傳輸角度、棱鏡組頂角和材料折射率推導Amici棱鏡組的非線性設計方程，并利用小角度近似推導出的線性方程組計算初始解。在初始解的基礎上進行非線性優化，最終找到滿足線色散的共軸直視型Amici棱鏡組。

3.1　線性和非線性設計方法

根據斯涅爾定律和幾何關系可以得出光線在棱鏡組中各角度關系：

圖2　Amici棱鏡分光示意圖

假設波長和折射率近似呈線性關系，中心波長的色散可以寫成：

根據棱鏡材料的平均折射率可計算各元素的頂角：

實際上，大多數棱鏡不能完美滿足小角度近似，因此在設計過程中一般使用線性方程得到初始解，然后利用光學設計軟件進行最終的非線性優化。直視系統中目標值，°，光譜波段為400～700 nm。假設系統材料分別為BK7和SF6，在滿足目標值的條件下，棱鏡頂角的線性和非線性表示如圖3所示。

3.2　玻璃材料選擇

另一種表示光譜色散線性度的方法是取色散梯度的最大值和最小值之比，即光譜采樣率（Spectral Sampling Ratio， SSR），SSR表示光譜波段非線性色散偏差的最大量。若SSR=2，最短波長對應的光譜寬度為1 nm，則最長波長對應的光譜寬度為2 nm。

表1Amici棱鏡參數表

Tab.1　Parameters of Amici prism

3.3　雙Amici棱鏡

雙Amici棱鏡由3個棱鏡元素組成，結構完全對稱，如圖4所示。第一個棱鏡和第三個棱鏡完全一樣，具有相同的材料和頂角［11-12］。

圖4　雙Amici棱鏡示意圖

雙Amici棱鏡的對稱性表示其線性方程和Amici棱鏡組的線性方程幾乎相同，在第一個元素的表達式前乘以系數2得到［13］：

與式（5）相同，利用線性方程推導出棱鏡的頂角表達式為：

其線性方程組如下：

表2雙Amici棱鏡參數表

Tab.2　Parameters of double Amici prism

圖5　不同棱鏡角色散對比曲線

4 光學系統仿真

圖6　共聚焦顯微成像的光學仿真結果

根據圖6（a）可知，光束在像面上的色散距離為4.5 mm左右，即棱鏡的角色散為4°，色散線性程度與理論計算結果基本一致。

5 實　驗

實驗利用可變狹縫和單軸精密位移臺模擬電機移動，白光通過光纖進入準直透鏡后經過棱鏡分光，再由透鏡將光譜帶聚焦在狹縫面。這里選擇頂角為60°的等邊色散單棱鏡和由3個等邊棱鏡膠合成的雙Amici棱鏡進行實驗。其中，雙Amici結構在棱鏡組合外層選擇低色散材料，內層為高色散材料。因此，在有限范圍內外層選擇F2材料（d=36.37），內層選擇N-SF11材料（d=24.76）。實驗測試平臺如圖7所示。

圖7　棱鏡線性度測試平臺

圖8　實驗與理論對比結果

圖9　共聚焦顯微鏡照片

該雙Amici棱鏡結構經過實驗驗證后，放置到激光掃描共聚焦顯微鏡的光譜成像模塊中進行光譜成像實驗。圖9（a）是激光掃描共聚焦顯微鏡，圖9（b）是共聚焦產品的光譜成像模塊。

采用光譜成像技術對牛肺動脈內皮細胞切片進行了多通道熒光成像。該切片采購自賽默飛世爾科技公司，用DAPI、Alexa Fluor 488和MitoTracker Red 3種染料分別對牛肺動脈內皮細胞的細胞核、肌動蛋白和線粒體進行熒光標記。采用405，488和561 nm激光同時去激發樣本熒光，按照盡量避免熒光串色的原則設置3種熒光通道的帶寬，DAPI激發的熒光光譜設置為［460 nm，490 nm］，Alexa Fluor 488激發的熒光光譜設置為［520 nm， 540 nm］，MitoTracker Red激發的熒光光譜設置為［600 nm，630 nm］。三通道同時采集熒光圖像，成像時間約為5 s，圖像分辨率是2 048×2 048。圖10是三通道熒光成像圖片。從圖10可以看出，不同熒光通道得到的圖像形態完全不同，說明不同熒光標記的細胞結構都能夠很好地呈現出來，幾乎不存在熒光串色問題。

圖10　牛肺動脈內皮細胞熒光成像

6 結　論

高分辨顯微成像近年來發展迅速，激光掃描共聚焦相比于生物熒光顯微鏡具有高分辨率和寬光譜成像的優勢。目前，市面上共聚焦光譜模塊多選擇單棱鏡或光柵作為分光元件。光柵雖然能實現更高的光譜分辨率下，但其熒光傳輸效率較低；單棱鏡一般選恒偏向角棱鏡，其分光具有較嚴重的色散不均勻性且光路需要通過反射鏡轉折。本文針對直視型共軸分光棱鏡展開研究，提出Amici棱鏡和雙Amici棱鏡組的初始結構計算方法，并利用優化算法給出了線性度較好的棱鏡組結構參數。最終選擇雙Amici棱鏡作為光譜模塊的分光元件，通過光學仿真實現了目標色散和中心波長零偏轉，整個光學模塊結構簡單、緊湊。實驗結果表明：雙Amici棱鏡結構相比單棱鏡具有更好的光譜線性度，可以提高光譜成像時光譜選擇的準確性。

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Design of laser scanning confocal spectroscopy system

ZHOU Minchao1，2，WANG Zhenya2*，WANG Bidou2，LUO Gangyin2，MA Siqi2

（1，，200433，；2，，215163，），：

A spectral structure for the double Amici prism was designed to improve the spectroscopic performance of a laser scanning confocal microscope spectroscopy module. Linear and nonlinear mathematical models were formulated for the Amici and double Amici prisms， and the structure parameters of direct-viewing prism were chosen according to the prism dispersion characteristics. The structures of the Amici and double Amici prisms were compared for the same dispersion conditions， and the double Amici prism group was found to provide better dispersion linearity. A common optical axis direct vision spectroscopic system was developed using a double Amici prism for a 400-700 nm spectral range and 5 nm spectral resolution， with central wavelength deviation angle of 0° and maximum dispersion angle of 4°. The experimental results show that the dispersion linearity of this structure is significantly better than that of a single prism. Spectral resolution issues caused by the nonlinear spectroscopic characteristics of prisms are greatly reduced.

laser scanning confocal； Amici prism； dispersion linearity； common optical axis direct vision

TH744.1

A

10.37188/OPE.20223003.0237

1004-924X（2022）03-0237-09

2021-10-12；

2021-11-10.

中國科學院科研儀器設備研制項目（No.Y822141202）

周旻超（1985），男，江蘇江陰人，碩士，副研究員，2011年于南京理工大學獲得碩士學位，主要從事高/超分辨顯微成像的研究。E-mail：zhoumc@sibet.ac.cn

王振亞（1993），男，江蘇鎮江人，碩士，助理研究員，2018年于蘇州科技大學獲得碩士學位，主要從事高/超分辨顯微成像的研究。E-mail：wangzy@sibet.ac.cn