近海淺海海水弗朗西斯菌的分離培養和鑒定

陳富 李敏 馮俊慧 羅海敏 李良慧 廖煥蘭 屈平華 李松

1廣州市番禺區健康管理中心，廣州 511490；2中山大學腫瘤防治中心，廣州 510006；3廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510006；4廣州中醫藥大學第二附屬醫院 廣東省中醫院檢驗醫學部，廣州 510006

弗朗西斯菌是一類革蘭染色陰性、營養要求苛刻、專性需氧的球桿菌。其廣泛存在于海洋、淡水、人工水、土壤等自然生境中，可通過接觸病畜、食入污染的食物、吸入污染空氣等多種方式傳播給人類，且臨床感染遍布全球，僅蜃樓弗朗西斯菌的臨床感染報道就有幾十例［1］，目前在我國也有相應的感染報道的案例［2］。弗朗西斯菌多數都是存在近海淺海海水中，而我國近海漁作業非常發達，作業人數眾多，有一定的感染風險，因我們對這方面的了解極少，為加深對這一方面的認識和探索，本課題組就廣東近海淺海中海水的弗朗西斯菌和鄰近兼性胞內寄生菌的進行分離培養和多樣性研究，以了解近海淺海海水的弗朗西斯菌和鄰近兼性胞內寄生菌的分布情況。

材料與方法

1、材料

1.1、儀器和試劑 （1）主要儀器：分析精密電子天平T-114（美國丹佛儀器公司），高壓蒸汽滅菌器（以色列騰氏公司），漩渦混合器Vortex（上海醫大儀器廠），5% CO2恒溫孵育箱（北京東方精瑞科技發展有限公司），恒溫金屬浴SH2-82（廣州譽維生物科技儀器有限公司），冷凍離心機Eppendorf 5804R（德國Eppendorf 公司），微量離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司），Veriti 96 well PCR 儀（美國ABI公司），凝膠電泳儀DYY-7C（北京六一儀器廠），全自動凝膠成像系統（英國Syngene 公司）。（2）主要試劑：BHI 瓊脂基礎，軍團菌CYE 瓊脂基礎，GVPC 選擇性添加試劑（均購自英國OXOID 公司）；軍團菌BCYE 添加劑：ACES 顆粒、氫氧化鉀、α-酮戊二酸、焦磷酸鐵、L-半胱氨酸（均購自上海生工生物工程有限公司）；2216E 液體基礎（購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；革蘭染色、氧化酶及觸酶試劑（均購自法國生物梅里埃中國有限公司），Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑，Premix EX Taq Version 2.0，DL 2000 Marker（均購自上海生工生物工程有限公司），細菌16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R（購自上海英駿公司），Goldview 核酸染料（購自廣州翔博生物科技有限公司）。

1.2、培養基的制備 BCYEα-2216E 培養基：CYE 瓊脂基礎12 g，ACES 顆粒5 g，氫氧化鉀1.4 g，α-酮戊二酸0.5 g，焦磷酸鐵0.125 g，L-半胱氨酸0.2 g，瓊脂粉1 g，2216E 基礎18.7 g，去離子水500 ml。BCYEα-2216E-GVPC 培養基：CYE 瓊脂基礎12 g，ACES 顆粒5 g，氫氧化鉀1.4 g，α-酮戊二酸0.5 g，焦磷酸鐵0.125 g，L-半胱氨酸0.2 g，瓊脂粉1 g，2216E 基礎18.7 g，甘氨酸1.5 g、萬古霉素0.000 5 g、放線菌酮0.04 g 和多粘菌素B 40 000 U，去離子水500 ml。BHI-2216E-GVPC 培 養 基：BHI 瓊 脂 基 礎12.5 g，氯 化 鐵0.162 5 g，L-半胱氨酸0.2 g，瓊脂粉2.5 g，2216E基礎18.7 g，甘氨酸1.5 g、萬古霉素0.000 5 g、放線菌酮0.04 g 和多粘菌素B 40 000 U，去離子水500 ml。

2、方法

2.1、水樣采集 于2019年10月4日茂名市電白區水東灣進行多位點采集水樣19份；于2019年8月12日惠州市兩大灣（巽寮灣、雙月灣）進行多位點采集水樣29份。

2.2、水樣處理及培養 將采集的海水充分搖勻后，取100 ml 使用孔徑為0.2 μm 的纖維素濾膜過濾濃縮，取濾膜對折剪碎后，置于新的5 ml EP 管中，加入3 ml原海水，在震蕩儀上充分震蕩，然后從中取1 ml，按1∶1 的比例加入1 ml KCl-HC（l18∶1）進行酸處理，震蕩搖勻后靜置5 min。將50 μl上述處理后的海水密集涂布于BHI-2216E-GVPC、BCYEα-2216E-GVPC兩種培養基上，在25 ℃的5%CO2恒溫孵育箱中培養3～7 d。

2.3、菌株鑒定

2.3.1、菌株形態和生理生化鑒定 定期觀察培養基上菌落的生長情況，觀察菌落特征并進行革蘭染色觀察，鑒定方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，挑選表面及邊緣光滑、濕潤、扁平、圓形、灰白色、半透明的疑似目標菌落進行觸酶、氧化酶的生理生化檢測，其傳代培養和純化均于BCYEα-2216E培養基上完成，培養條件與2.2一致。

2.3.2、16S rRNA基因測序 在BCYEα-2216E培養基上挑取3～4個實驗菌株典型的菌落置于100 μl的DNA抽提試劑，并均勻研磨，充分混勻后置入恒溫金屬?。?05 ℃，10 min），在12 000 r/min的條件下離心3 min（離心半徑為9.5 cm），吸取含DNA 的上清液，備用。引物序列正向：27F 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’，反向：1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’進行PCR 擴增。PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行測試。DNA marker 取5 μl，每個樣品取5 μl，電泳條件參數：120 V，25 min。電泳結束后將凝膠放進成像儀進行掃描成像觀察條帶：16S rDAN 條帶應于1 400 bp 附近。取條帶陽性、擴增良好的樣品送廣州艾基生物技術有限公司進行單向測序。

2.3.3、16S rRNA 基因序列比對 使用chromas 軟件查看序列峰圖，判斷所得序列是否符合長度和質量的要求，然后將合格的序列使用DNAMAN 軟件進行拼接，并在NCBI Blast數據庫上進行相似度搜索并分析比對結果。

結 果

1、分離培養結果

水東地區采取的19 份水樣，其中14 份（陽性率73.7%）水樣培養出目標菌菌株共60 株，惠州地區采取的29 份水樣，其中17 份（陽性率58.6%）水樣培養出目標菌菌株共79 株。處理后的海水在BHI-2216E-GVPC 培養基和BCYEα-2216E-GVPC 培養基上于35 ℃培養3 d 后，可見灰白色，有光澤，濕潤，有明顯邊界的大小1.5～3.0 mm 左右的目標菌落（圖1），將目標菌落于血平板和BHI-2216E 培養基上進行生長試驗，可見培養3 d后目標菌在血平板上菌落細小，明顯生長不良或生長緩慢，而BHI-2216E培養基上生長良好。

圖1 各分離培養基上目標菌的生長情況。A為BHI-2216E-GVPC 培養基；B為BCYEα-2216E-GVPC 培養基；C為BCYEα-2216E培養基；D為在BCYEα-2216E上分純

2、目標菌株及生理生化特征

挑取目標菌落涂片并進行革蘭染色。革蘭染色陰性，淡染，呈細砂狀，多形態性，表現為豆形、球形、桿狀或絲狀等形態，無鞭毛無動力，無芽胞（圖2）。常規生理生化反應結果：觸酶弱陽性，氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗陰性，脲酶陰性。

圖2 目標菌革蘭染色顯微圖。A為低倍鏡下目標菌的形態圖（10×10）；B為油鏡下目標菌的形態圖（40×10）

3、16S rRNA分子鑒定結果

挑選目標菌的單個菌落進行純培養，對純培養轉代后的菌進行保存，選用弗朗西斯菌通用引物進行PCR擴增，擴增后的產物送公司進行測序，測序結果在gen-bank 上進行比對。水東地區采取的19 份水樣，其中14 份（陽性率73.7%）水樣培養出目標菌菌株共60 株，其中弗朗西斯菌屬（有潛在新種）12 株（20.0%），嗜半胱氨酸菌屬45 株（75.0%），方氏菌屬1株（1.7%），其他臨近屬（潛在新科）2株（3.3%）；惠州地區采取的29 份水樣，其中17 份（陽性率58.6%）水樣培養出目標菌菌株共79 株，其中弗朗西斯菌屬（有潛在新種）22 株（27.8%），嗜半胱氨酸菌屬35 株（44.3%），方氏菌屬4 株（5.1%），其他臨近屬（潛在新科）18株（22.8%）。具體見表1。

表1 不同采樣地點16S rRNA基因序列比對結果

討 論

弗朗西斯菌是一種寄養的，兼性細胞內寄生的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于土壤、海洋、沼澤或小型哺乳動物、海洋魚類、貝殼類等自然宿主體內。可通過空氣中的氣溶膠、接觸疫水、創傷性傷口和接觸弗朗西斯菌的自然宿主等方式感染人類［3］。最引起我們關注的是，

土拉弗朗西斯菌引起的人畜共患的土拉熱病，隨著各地都有爆發的土拉熱病的報道，感染后具有發病率高、毒性大、傳播性強等特點，而且日本、德國等都有對其作為生物戰劑研究，所以美國以此作為長期防生化恐怖的重點監測目標。之前報道的土拉弗朗西斯菌感染途徑主要是小哺乳動物宿主、節肢動物的叮咬等直接接觸的傳播途徑，而1997 年西班牙爆發了水源性污染的土拉熱病，土耳其也爆發了3 次的水源性污染的土拉熱病，全球范圍內也有多例的蜃樓弗朗西斯菌，且主要都是存在于近海淺海的海水里或咸水源中，對病原菌的分離培養和鑒定以了解其分布特點的重要性［4］。因此，海水或咸水也是弗朗西斯菌存在的重要地方，水源性的感染傳播途徑不容忽視，本文就近海淺海的海水中弗朗西斯菌的分離培養作為研究報道。

從我們分離軍團菌屬和弗朗西斯菌科細菌的經驗來看，采樣地點的選擇、樣本前處理策略以及培養基的選擇和優化等，會大幅度提高其分離培養效果，并增加其相關類群的物種多樣性描述。本項目團隊在2011 年至2015 年間對1 288 份淡水進行弗朗西斯菌培養，但由于受到方法學上局限以及水樣的選擇不同上，僅檢出3 份陽性水樣，陽性率不足1%；而在2016年至2018年間，我們通過采樣地點的選擇以及采用熱孵育和酸處理等釋放原蟲宿主內細菌和抑制其他雜菌生長的方法，分離的陽性率得以大幅度提高，在181 份海水和鹽水湖標本中檢出49 份陽性樣品，并分離和描述了另弗朗西斯菌［5］、假弗朗西斯菌屬［6］、嗜半胱氨酸菌［7］、苛養桿菌屬［8］、易生桿菌屬［9］和慶義軍團菌［10］等5 個屬10 余種。本文在進一步改良的模擬海水環境的CHABBHI-2216E-GVPC 培養基和增加廣東地區近海淺海不同采樣地點上多點采樣，培養溫度的控制，并根據細菌生長的適宜溫度與海水溫度之間差異的改變而嘗試不同溫度進行培養，發現在20～25 ℃之間適當延長培養時間，更能有機會發現目標菌。而我們在48 份海水中分離到31 份陽性水樣，陽性率明顯提高，對目標菌和相近菌種的獲取概率也大大提高。

在進一步在近海淺海的分離鑒定中，不同地點的海水有著不同的溫度、不同的鹽度、不同的流動方向和速度等，都存在著不同的生態微環境，這也是導致菌群不一致的主要原因。而從本研究不同地點采集的水樣分離結果來看，菌屬的檢出和比例都明顯不同，水東地區的陽性水樣中的目標菌大部分鑒定為嗜半胱氨酸菌屬，占比高達75.0%，與惠州的嗜半胱氨酸菌屬（44.3%）相差甚遠。兩個地方一共分離到弗朗西斯菌34 株，部分菌株的測序結果的對比相似度小于98.75%，根據最新的細菌分類指南里面對新種測序結果的要求，這些菌株存在新種的可能，后續我們會對潛在的新種按照新種確認的最低要求進行相關的檢測。同時將對分離出的20株疑似新科的細菌進行后續確認檢測工作。

通過分離培養條件的改進后，這次分離培養的陽性率明顯提高，而且分離到多株弗朗西斯菌，且可能存在弗朗西斯菌的新種，還有多株接近于弗朗西斯菌的潛在新科新屬等。同時了解到廣東地區近海淺海海水中弗朗西斯菌種非常豐富，且存在不同的新種以及可能存在鄰近菌屬。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突