LINC01836是一種新的結直腸癌診斷和預后的生物標志物

趙文鎮 林宇寧

1福建省廈門醫學院，廈門 361023；2福建醫科大學附屬廈門弘愛醫院醫學檢驗中心，廈門 361009

結直腸癌包括結腸腺癌和直腸腺癌。結直腸癌的發病率排名第3（占總病例的10.2%），是全世界癌癥相關死亡的第2 大原因（占所有病例的9.2%）［1］。在過去幾十年中，全球結直腸癌的發病率和病死率穩步下降；然而，結直腸癌仍然是最常見的胃腸道惡性腫瘤和第2 大癌癥相關疾病的死亡原因［2］。目前，結直腸癌的唯一治療方法是手術切除，而化療只能維持一定的生存率［3］。化療和手術切除治療惡性結直腸癌的手段正在增加，但這些治療的效果沒有明顯改善。大約一半的結直腸癌復發，患者在5 年內死亡［3-4］。結腸腺癌被認為是由遺傳和表觀遺傳變化引起的，這些變化啟動了癌癥的發展并促進了癌癥的進展。癌基因作為腫瘤治療的靶點，促進腫瘤細胞的生長和轉移，已被廣泛認識［5］。生物標志物可作為預后指標、分子預測因子和靶向治療的決定因素［6-7］。許多預后標志物已在結直腸癌中被評估。然而，大多數是實驗性的，或者不是前瞻性的驗證［8］。

lncRNAs 是≥長度為200 個核苷酸，調節一系列細胞生物學過程，包括染色質重塑、轉錄和轉錄后調節［9］。lncRNAs 最為公認的分子機制是充當miRNA“海綿”來調節下游靶基因［10］。lncRNAs 在各種類型的癌細胞中異常表達，并在幾種常見的癌癥標志物中發揮重要作用［11］。

本研究旨在尋找和結直腸癌發展進程相關的lncRNAs，研究其作為結直腸癌患者診斷和預后的新型生物標志物的可能性。

資料與方法

1、RNA測序數據與生物信息學分析

筆者從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載2020 年4月7日發布的V23.0版本的結直腸癌患者基因表達譜數據中698 例level 3 HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 數據和臨床信息，包括50 例配對的結直腸癌旁正常組織。然后將FPKM 格式的數據轉換為TPM 格式用于后續分析。筆者還在TCGA 和基因型組織表達（Genotype Tissue Expression，GTEx）數 據 庫（https：//xenabrowser.net/datapages/）中 下 載TPM 格式的RNA 序列數據，該數據庫由UCSC Xena 的Toil過程統一處理［12］。本研究中執行的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》（2013年修訂）。

2、統計學分析

所有統計分析均采用R（v.3.6.3）進行。不同組織中的LINC01836 表達的差異采用Wilcoxon 秩和檢驗，臨床病理特征與LINC01836之間的關系采用卡方檢驗、Fisher精確檢驗和logistic 回歸分析。采用Kaplan-Meier 方法計算TCGA中的結直腸癌患者的總生存率。P＜0.05 差異有統計學意義。

結 果

1、LINC01836在結直腸癌組織中高表達

為了確定結直腸癌和正常組織中LINC01836 表達的差異，筆者分析了698 個結直腸癌組織和51 個癌旁正常組織中LINC01836 的表達水平，發現LINC01836 在結直腸癌組織 中高表達（P＜0.001，圖1A）。同時，筆者還 分 析 了LINC01836在50例結直腸癌組織及其配對癌旁正常組織中的表達情況，結果同樣表明結直腸癌組織高表達LINC01836（P＜0.001，圖1B）。 此 外，筆 者 還 比 較 了TCGA_GTEx 中383 例TCGA 結直腸癌樣本和359 例對應的正常結直腸組織LINC01836 的表達，結果表明LINC01836 在結直腸癌組織樣本中顯著高表達（P＜0.001，圖1C）。

圖1 LINC01836在結直腸癌組織、癌旁正常組織、正常組織中的差異表達。A：TCGA中LINC01836在結直腸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達。B：TCGA 中LINC01836在結直腸癌組織和其配對癌旁正常組織的差異表達。C：TCGA_GTEx中LINC01836在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的差異表達

2、LINC01836的診斷價值

使用ROC分析LINC01836表達水平對區分結直腸癌組織和非癌組織的有效性，結果顯示LINC01836 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.907（圖2A）。TCGA_GTEx中，納入了正常組織數據后分析，AUC 為0.899，表明LINC01836 可作為區分結直腸癌與正常組織的理想生物標志物（圖2B）。

圖2 ROC 分析LINC01836對結直腸癌的診斷價值。A：ROC 顯示TCGA 中LINC01836 表達水平對區分結直腸癌組織和癌旁正常組織的有效性。B：ROC 顯示TCGA_GTEx 中LINC01836 表達水平對區分結直腸癌組織和正常結直腸組織的有效性

3、LINC01836與結直腸癌患者臨床特征的關系

患者臨床特征如表1所示，篩選得到644例同時具有臨床特征和基因表達數據，根據LINC01836 表達的中位數值，將結直腸癌患者分為高（322 例）和低（322 例）表達組。通過卡方檢驗或Fisher檢驗，結果顯示LINC01836表達在不同的N 分期、M 分期、病理分期、淋巴侵犯和結腸息肉差異均有統計學意義（均P＜0.05）。同時logistic 回歸分析結果表明：高表 達 的LINC01836 與N 分 期進 展（OR=1.469，P=0.017）、M 分期進展（OR=2.131，P=0.002）、病理分期進展（OR=1.580，P=0.005）、淋巴侵犯（OR=1.826，P＜0.001）、結腸息肉相關（OR=0.576，P=0.025），見表2。

表1 LINC01836表達與結直腸癌的臨床病理特征的相關性

表2 LINC01836表達與臨床病理特征相關性分析（logistic回歸）

4、LINC01836表達與結直腸癌患者預后不良相關

根據中值將LINC01836 表達值分為高表達組和低表達組。通過Kaplan-Meier 生存分析評估LINC01836 表達與結直腸癌患者總體生存率之間的相關性，結果表明LINC01836 高表達與結直腸癌患者總體生存率低相關（P=0.002）（圖3）。

圖3 Kaplan-Meier 生存分析評估LINC01836 對結直腸癌患者的預后價值

討 論

lncRNAs 在不同的基因表達水平發揮調節功能，包括染色質修飾、轉錄和轉錄后［13］。lncRNAs 可與染色質重塑復合物相互作用，在特定基因組位點誘導異染色質形成并降低基因表達。此外，lncRNAs 與RNA 結合蛋白和轉錄因子共激活劑相互作用，或通過調節其靶基因的主要啟動子來調節轉錄。作用機制方面，lncRNAs 可以與DNA、mRNAs、ncRNAs 和蛋白質進行通信，并發揮與癌癥相關的調節作用，如成為通信信號、誘導信號傳遞、協助基因轉移、成為信號傳遞支架和信號傳遞向導等［14-15］。此外，lncRNAs通常參與大腸癌的不同階段，從癌前息肉到遠處轉移，這可以被視為潛在的有效診斷生物標志物［16-17］。

目前，結直腸癌的主要治療方法是手術切除，化療只能維持一定的生存率。有研究通過改變手術方式來改善結直腸癌的治療效果，如張銳江等［18］研究指出，腹腔鏡結直腸癌根治術的治療對患者胃腸功能恢復、減少出血量有幫助。免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）也是結直腸癌的治療手段之一，目前研究較多，療效較好［19］。

LINC01836是一種新的lncRNAs，目前研究較少。本研究主要發現了LINC01836 在結直腸癌組織中的表達量高于鄰近非癌組織，與此同時，LINC01836 在結直腸癌組織中的表達也高于正常人群的結直腸組織，并初步證明LINC01836 具有一定的結直腸癌診斷價值。本研究還綜合分析了LINC01836 的表達與結直腸癌患者的臨床病理特征，發現LINC01836 與結直腸癌的N 分期進展、M 分期進展、病理分期進展、淋巴侵犯和結腸息肉相關。通過Kaplan-Meier 生存分析發現，在結直腸癌組織中，高表達的LINC01836 與患者預后較差相關，因此LINC01836 還存在一定的預后價值。

綜上所述，LINC01836 是一個新的lncRNAs，目前研究較少。本研究發現在結直腸癌組織中的高表達LINC01836 對結直腸癌的診斷和預后評價有一定的價值。但本研究也存在一定的不足之處，在本研究中，并未將LINC01836 的表達與腫瘤免疫微環境進行聚類分析，因此，LINC01836 是否有望成為免疫抑制劑治療結直腸癌新的靶點仍需討論，在后續的研究中，可以針對LINC01836 與免疫細胞的關系設計實驗并加以驗證。