二苯乙烯苷調控miR-34a/SIRT1對骨質疏松大鼠的作用及機制研究

王奇 楊鵬 孫建軍 姚紹華

萍鄉市第二人民醫院骨科，江西 萍鄉 337000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是多發于老年及絕經后婦女的一種以骨量減少、骨結構異常及骨脆性增加為特征的代謝性骨骼疾病，可導致骨折，嚴重影響患者生命健康[1-2]。研究[3]發現，氧化應激可導致成骨細胞凋亡、減弱成骨分化，與OP患者骨密度及骨量減少關系密切。研究[4]報道，何首烏中有效成分-二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene glycoside，TSG)具有較好的抗氧化應激作用，能通過降低成骨細胞氧化應激水平來抵抗成骨細胞凋亡，這預示TSG可能對OP骨丟失有一定的治療作用，但其作用機制還不明確。微小RNA(microRNA，miRNA)是骨骼代謝的重要調節劑，研究[5]發現在骨密度(bone mineral density, BMD)異常降低的老年人體內miR-34a水平顯著高于正常成年人，且miR-34a也可靶向調控沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表達來調控細胞氧化應激、衰老及凋亡等多種生理過程[6]。但miR-34a/SIRT1是否能通過調控氧化應激及凋亡作用，來緩解OP患者骨密度降低及骨丟失進程，目前還研究較少。本研究將通過體內與體外實驗相結合，探討二苯乙烯苷(TSG)調控miR-34a/SIRT1對骨質疏松大鼠的作用及機制，為TSG的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞：SPF級SD雌性大鼠60只，體重200～220 g，6～7周齡，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，動物生產許可證號為：SCXK(京)2016-0009，動物使用許可證號為：SYXK(京)2017-0016，動物質量合格證號為：K501397。本試驗符合3R原則并經萍鄉市第二人民醫院倫理委員會批準。小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1購自上海冠導生物工程有限公司，批號：GD-C18518572。

1.1.2主要試劑及儀器：TSG(南京澤朗生物科技有限公司，原料藥，純度≥98%，批號：BW1537)；miR-34a過表達載體溶液、miR-34a過表達陰性載體溶液(北京索萊寶科技有限公司，批號：SL1048、SL1050)；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司，批號：SY6488、SY6454、SY3017、SY0209、SY7003)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Hoechst33258染色液(上海愛必信生物科技有限公司，批號：abs9217、abs5002、abs7114、abs4018)；堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣蛋白(OCN)、SIRT1、β-actin單克隆抗體、羊抗鼠二抗(美國abcam公司，批號：ab186421、ab63856、ab92876、ab189494、ab109937、ab110035)；小動物顯微CT(Micro-CT)系統(廣州中科愷盛醫療科技有限公司，型號：ZKKS-MCT-SHARP)；實時熒光定量PCR儀(蘇州雅睿生物技術有限公司，型號：MA-6000)；凝膠成像儀(美國伯樂公司，型號：SYSTEM GelDoc XR+)；光學顯微鏡、熒光顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司，型號：DMM-300 D、XSP-13CC)等。

1.2 方法

1.2.1大鼠OP模型建立及分組給藥：大鼠參照文獻[7]摘除雙側卵巢建立OP模型，并于手術后一周，隨機取兩只大鼠股骨遠端標本，參照文獻[8]方法對大鼠股骨進行Micro-CT掃描，若大鼠出現骨結構斷裂，骨量減少現象視為造模成功。共造模成功50只大鼠，隨機分為模型組、TSG組(80 mg/kg)、miR-34a過表達(miR-34a-agomir)組(4 nmol/kg)、TSG+miR-34a-agomir組(80 mg/kg+4 nmol/kg)、miR-34a過表達陰性對照(antagomir-NC)組，每組10只。另取10只大鼠只暴露卵巢，不摘除，其余同模型組，視為假手術組。TSG參照文獻[9]設置劑量，并用生理鹽水溶解成濃度為8 mg/mL的溶液，按10 mL/kg的劑量灌胃給藥，1次/d，miR-34a-agomir及antagomir-NC組參照文獻[5]設置劑量，經尾靜脈注射給藥，1次/周；TSG+miR-34a-agomir組灌胃給予TSG同時，經尾靜脈注射給予相應劑量miR-34a-agomir；模型組及假手術組給予相應劑量的生理鹽水。各組連續給藥3個月。

1.2.2大鼠血液標本及股骨遠端標本采集：各組大鼠末次給藥，禁食禁水12 h后，麻醉取腹主動脈血6 mL，于3 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液置于無酶EP管中- 80 ℃保存備用。斷頭處死大鼠，取大鼠左右兩后肢股骨，仔細分離并剔除骨組織周圍的肌肉和軟組織，左側股骨用生理鹽水紗布包裹后，于- 80 ℃保存備用，右側股骨標本用醫用紗布包裹后，置入10倍體積的4 %多聚甲醛中固定備用。

1.2.3大鼠血清MDA、GSH-Px水平檢測：取大鼠血清標本，于4 ℃條件下解凍后，按MDA、GSH-Px試劑盒說明書方法檢測血清中MDA、GSH-Px水平。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測大鼠血清miR-34a相對表達水平：取先前在- 80 ℃冰箱中保存的血清標本，在4 ℃冰箱中解凍后，于3 000 r/min、4 ℃條件下再次離心20 min后，用Trizol試劑提取總RNA并以總RNA為模板，反轉錄cDNA。取cDNA，按熒光定量PCR試劑盒說明書和PCR儀進行擴增，共進行50個循環：90 ℃ 100 s(1個循環)，95 ℃ 20 s、50 ℃～55 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s(40個循環)，72 ℃ 100 s(1個循環)后終止反應。miR-34a以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-34a相對表達水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設計見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.5蛋白免疫印跡(WB)法檢測血清SIRT1蛋白相對表達水平：取先前在- 80 ℃冰箱保存的血清標本，在4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度，取25 μg蛋白進行電泳、轉膜反應及封閉液封閉后，加入一抗[SIRT1(稀釋倍數1∶500)、β-actin內參(稀釋倍數1∶1 000)]孵育過夜后，加入羊抗鼠二抗(1∶2 000)在37 ℃條件下孵育3 h后，用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

1.2.6HE染色及Micro-CT法檢測股骨組織結構變化：取右側后肢股骨遠端標本，進行螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋后，切成厚度為5 μm切片，按HE試劑盒說明書進行染色、封片后置于顯微鏡下觀察病理變化。取左側股骨遠端標本，按照文獻[8]方法對大鼠股骨進行Micro-CT 掃描，并計算骨連接密度(Conn.D)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、BMD等指標。

1.2.7成骨細胞培養及分組處理：參照文獻[4]取成骨前體細胞MC3T3-E1用α-MEM培養基于孵箱里培養、胰蛋白酶消化處理后，接種到6孔板中，并分為對照組、過氧化氫(H2O2)處理組、TSG組、miR-34a-mimic組、miR-34a-NC組、TSG+miR-34a-mimic組，對照組不做任何處理正常培養外，其余各組均加入300 μmol/L H2O2處理24 h，TSG組在H2O2處理組基礎上加入終濃度為10 μmol/L的TSG進行培養，miR-34a-mimic組及miR-34a-NC組分別轉染miR-34a激動劑及其陰性對照試劑，TSG+miR-34a-mimic組在TSG組基礎上轉染miR-34a-mimic試劑，各組均轉染培養24 h。

1.2.8Hoechst33258染色觀察細胞凋亡情況：取1.2.7項下的各組細胞，參照文獻[4]方法，取細胞用4 %多聚甲醛固定后加5 mg/L Hoechst33258染液染色、甘油封片后，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡狀態。

1.2.9qRT-PCR及WB法檢測各組細胞miR-34a及SIRT1、ALP、OPN、OCN蛋白表達：取1.2.7項下的各組細胞，用Trizol抽提法提取細胞中總RNA后，按1.2.4項下方法檢測細胞中miR-34a表達。取1.2.7項下的各組細胞，用蛋白裂解液裂解、蛋白提取試劑盒提取蛋白、BCA法檢測蛋白濃度后取20 μg進行電泳及轉膜反應后，加入一抗[SIRT1、ALP、OPN、OCN(稀釋倍數均為1∶1 000)，β-actin內參(稀釋倍數1∶2 000)]孵育過夜后，按1.2.5方法檢測細胞中SIRT1、ALP、OPN、OCN蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TSG對OP大鼠血清miR-34a及SIRT1蛋白表達變化的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清miR-34a表達升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比，TSG組大鼠血清miR-34a表達降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達升高(P<0.05)；miR-34a-agomir組大鼠血清miR-34a表達進一步升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達進一步降低(P<0.05)。TSG+miR-34a-agomir組大鼠上述指標變化與TSG組相反且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠血清SIRT1蛋白表達免疫印跡圖Fig.1 Western blot of SIRT1 protein expression in serum of rats in each group 注：A：假手術組；B：模型組；C：TSG組；D：miR-34a-agomir組；E：TSG+miR-34a-agomir組；F：agomir-NC組。

2.2 TSG對OP大鼠股骨遠端組織病理變化的影響

表2 各組大鼠血清miR-34a及SIRT1蛋白表達比較

假手術組骨組織結構完整，骨小梁排列有序、粗細均勻且結構致密，成骨細胞形態清晰。模型組大鼠可見股骨遠端松質骨小梁斷裂、減少且排列稀疏，骨細胞減少且結構模糊。TSG組大鼠可見松質骨骨小梁排列較致密且斷裂較少，成骨細胞相對模型組較多。miR-34a-agomir組大鼠骨小梁斷裂、減少、排列疏松現象較模型組嚴重。TSG+miR-34a-agomir組及agomir-NC組骨組織上述病理損傷程度與模型組相近。見圖2。

圖2 大鼠股骨遠端組織HE染色圖(40×)Fig.2 HE staining of distal femur of rats in each group (×40)

2.3 TSG對大鼠骨組織超微結改變的影響

與假手術組相比，模型組大鼠Conn.D、Tb.N、BMD降低(P<0.05)，Tb.Sp升高(P<0.05)。與模型組相比，TSG組大鼠Conn.D、Tb.N、BMD升高(P<0.05)，Tb.Sp降低(P<0.05)；miR-34a-agomir組大鼠Conn.D、Tb.N、BMD進一步降低(P<0.05)，Tb.Sp進一步升高(P<0.05)。TSG+miR-34a-agomir組大鼠上述指標變化與TSG組相反且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 股骨遠端的顯微CT成像Fig.3 Micro CT imaging of distal femur of rats in each group

2.4 TSG對大鼠血清MDA、GSH-Px變化的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清GSH-Px水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。與模型組相比，TSG組大鼠血清GSH-Px水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)；miR-34a-agomir組大鼠血清GSH-Px水平進一步降低(P<0.05)，MDA水平進一步升高(P<0.05)。TSG+miR-34a-agomir組大鼠上述指標變化與TSG組相反且差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.5 TSG對成骨細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下顯示，對照組成骨細胞結構正常。H2O2處理組可見成骨細胞核固縮、碎裂等凋亡現象嚴重。TSG組成骨細胞核固縮、碎裂等凋亡現象相對較輕。miR-34a-mimic組成骨細胞核固縮、碎裂等凋亡現象進一步加重。TSG+miR-34a-mimic組及miR-34a-NC組成骨細胞核固縮、碎裂等凋亡情況與模型組相近。見圖4。

表3 各組大鼠骨組織結構參數比較Table 3 Comparison of bone tissue structure parameters of rats in each group

表4 各組大鼠血清MDA、GSH-Px水平比較

圖4 各組細胞Hoechst33258染色圖(×400)Fig.4 Hoechst 33258 staining of cells in each group (×400)

2.6 TSG對成骨細胞miR-34a、SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達的影響

與對照組相比，H2O2處理組成骨細胞miR-34a表達升高(P<0.05)，SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達降低(P<0.05)。與H2O2處理組相比，TSG組成骨細胞miR-34a表達降低(P<0.05)，SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達升高(P<0.05)；miR-34a-mimic組成骨細胞miR-34a表達進一步升高(P<0.05)，SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達進一步降低(P<0.05)。TSG+miR-34a-mimic上述指標與TSG組相反且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 各組細胞SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達免疫印跡圖Fig.5 Western blot of SIRT1, ALP, OPN and OCN protein expression in each group注：A：對照組；B：H2O2處理組；C：TSG組；D：miR-34a-mimic組；E：TSG+miR-34a-mimic組；F：miR-34a-NC組。

3 討論

隨著我國老齡化人口的增多，OP發病率及致殘率逐年升高，大鼠切除卵巢是模擬人類絕經后OP的常見動物模型[10]，本研究以此建立OP大鼠模型，發現大鼠股骨遠端骨松質出現結構斷裂、骨量、骨小梁數量減少現象，且CT檢測發現骨組織超微結構Conn.D、Tb.N、BMD等參數降低，Tb.Sp等參數升高，提示造模成功。研究[3]發現氧化應激反應在OP過程中扮演重要角色，高水平的氧化應激反應可引起成骨細胞凋亡，減弱其分化，可能是導致OP患者骨組織及骨量丟失的原因之一。本研究在OP模型大鼠血清中檢測到氧化應激指標MDA升高、GSH-Px降低，證實氧化應激在OP過程中發揮重要作用。

表5 各組細胞miR-34a及SIRT1、ALP、OPN和OCN表達比較Table 5 Comparison of the expression of miR-34a, SIRT1, ALP, OPN and OCN in each group

中醫將OP歸屬為“骨萎”“骨枯”范疇，“腎精不足，骨髓化生及骨骼充養減弱”是其主要病機，補腎益精、填髓之物可促進骨髓化生及濡養，緩解OP骨死亡及枯竭[11]。中藥何首烏有補腎益精、填髓、強筋骨之功，是治療OP的常用藥物，其活性成份TSG具有較好的抗炎、抗氧化應激、抗凋亡等多種藥理作用[12]。本研究以TSG處理OP大鼠，發現大鼠股骨遠端骨松質結構斷裂緩解，骨量、骨組織體積分數、骨小梁數量及骨密度減少等均明顯得到改善，并伴隨著血清MDA降低、GSH-Px升高等氧化應激反應水平的降低，提示TSG可降低OP大鼠氧化應激水平，對其骨松質骨量減少、骨密度降低、骨結構異常有治療作用，但其分子機制還需繼續研究。

研究[13]發現，miRNA在OP患者血清及骨組織中表達異常，可作為OP篩查、診治的指標，其中miR-34a參與介導OP骨穩態調節過程，上調miR-34a水平，可導致骨髓間充質干細胞衰老凋亡，還能下調SIRT1表達，降低骨密度[14]；氧化應激反應是引發OP的重要機制之一[15]，而SIRT1能介導氧化應激、炎癥、自噬等多種生理過程，并可調控成骨細胞凋亡及分化，由此預測miR-34a/SIRT1可作為預治OP的潛在靶標。本研究檢測到OP大鼠血清中miR-34a表達升高，SIRT1表達降低，miR-34a-agomir組大鼠隨著miR-34a表達進一步升高及SIRT1蛋白表達的進一步降低，其骨量及骨密度減少也進一步加重，提示miR-34a上調，SIRT1下調可能是導致OP骨減少及骨密度下降的危險因子。TSG治療組血清中miR-34a下調，SIRT1上調，而TSG與miR-34a-agomir聯合應用后，大鼠miR-34a/SIRT1軸表達與TSG治療組相反，OP骨量減少及骨組織結構改變癥狀也進一步加重，推測miR-34a-agomir可逆轉TSG抑制OP骨量減少及組織結構改變的作用。另外本次體外試驗發現TSG干預可明顯降低H2O2誘導的成骨細胞氧化應激水平，并抑制其凋亡，降低miR-34a表達，上調SIRT1蛋白表達及成骨分化相關蛋白ALP、OPN和OCN的表達，促進成骨鈣化過程。而TSG與miR-34a-mimic聯合應用，其miR-34a及SIRT1蛋白表達與TSG單獨干預相反，且成骨細胞凋亡增加，成骨分化減弱，提示TSG可上調SIRT1蛋白表達，抑制氧化應激條件下成骨細胞的凋亡，促進成骨分化，且上述作用可被miR-34a-mimic逆轉。本研究體內外試驗均證實TSG可下調miR-34a，上調SIRT1，抑制成骨細胞凋亡，促進其分化，改善OP骨量減少及骨微結構異常改變的癥狀。

綜上所述，TSG可能通過抑制miR-34a表達、上調SIRT1蛋白表達來抑制氧化應激條件下成骨細胞的凋亡，促進其分化，改善OP大鼠骨量減少及骨組織結構異常的癥狀。但miR-34a/SIRT1信號軸調控機制復雜，TSG也可能通過miR-34a/SIRT1信號軸調控自噬、炎癥及破骨細胞凋亡等途徑來改善OP癥狀，這有待后續繼續研究。