利用Label-free技術(shù)篩選MC3T3-E1細(xì)胞中miR-381-3p介導(dǎo)的靶蛋白和差異蛋白生物學(xué)功能分析

陳錦成 朱國濤 秦曉飛 陳彥丞 羅駿 余博飛 吳宜璟 徐杰*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122 2.福建省立醫(yī)院骨二科，福建醫(yī)科大學(xué)，福建 福州 350001

肌少癥(sarcopenia)與骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)在臨床上關(guān)系緊密，但是聯(lián)系兩者間的機(jī)制尚未完全闡明。microRNA被證實(shí)密切參與骨骼肌肉代謝，有望成為聯(lián)系兩者間的新橋梁。本項(xiàng)目前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-381-3p在肌少-骨質(zhì)疏松癥(sarco-osteoporosis，SO)與OP患者中存在顯著的差異性表達(dá)(10.57倍)[1]，其可能參與肌少癥患者罹患OP的發(fā)生發(fā)展過程[2]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中初步證實(shí)了miR-381-3p可以通過介導(dǎo)ERK1/2/ETS1信號通路因子抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的機(jī)制，但是上述機(jī)制尚不能很好的解釋miR-381-3p調(diào)控機(jī)體骨代謝機(jī)制的全部內(nèi)容。

miRNA作為骨質(zhì)疏松癥和肌少癥的發(fā)生發(fā)展過程中重要的調(diào)控分子；成熟的miRNA通過形成沉默復(fù)合體，再通過完全或不完全配對與特定靶基因的3’UTR結(jié)合，起到抑制mRNA 翻譯或是直接降解mRNA 的作用，從而影響了靶點(diǎn)基因的表達(dá)水平。綜合miRNA調(diào)控機(jī)制存在多靶點(diǎn)與涉及廣泛信號通路因子的復(fù)雜性，本課題采用小鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)，基于慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建miR-381-3p在MC3T3-E1細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組(MC3-E1-in)與對照組(MC3-E1-NC-in)細(xì)胞模型，創(chuàng)新性運(yùn)用非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選miR381-3p在體外細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異蛋白質(zhì)譜，目的是盡最大可能鑒定出miR381-3p可能涉及的相關(guān)的分子信號通路或重要的轉(zhuǎn)錄因子以揭示其介導(dǎo)成骨分化與骨形成過程更多的調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選數(shù)據(jù)為課題組后續(xù)開展SO的更進(jìn)一步研究提供了參考靶蛋白與相關(guān)的信號通路信息及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑和耗材：Bradford試劑購自于碧云天；二硫蘇糖醇(DTTred，貨號：D9163-25 G)、碘代乙酰胺(IAM，貨號：I6125-25 G)、碳酸氫銨(貨號：5330050050)、三乙基碳酸氫銨緩沖液(貨號：T7408-500 ML)、氨水(貨號：221228-500 ML-A)均購自于Sigma；尿素和十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自于國藥；質(zhì)譜級胰酶(貨號：V5280)購自于Promega；LC-MS級超純水(貨號：W6-4)、LC-MS級乙腈(貨號：A955-4)、LC-MS級甲酸(貨號：A117-50)均購自于Thermo Fisher Chemical；丙酮(貨號：11241203810051)購自北京化工廠。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器：EASY-nLC 1200TM(型號：LC140)、Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀、酶標(biāo)儀均購自Thermo Fisher；低溫離心機(jī)(型號：D3024R)購自于Scilogex；冷凍干燥機(jī)(型號：Scan Speed 40)購自 Labogene；電泳儀、電泳槽均購自Bio-Rad；電子天平(型號：BSA124 S)購自Sartorius；渦旋混合器(型號：HY-6B)購自光合；制冰機(jī)購自雪科；超聲波細(xì)胞破碎儀(型號：JY92-11 N)購自寧波新芝。

1.2 方法

1.2.1MC3T3-E1成骨細(xì)胞總蛋白提取：MC3T3-E1成骨細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染成功并試試熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后，將細(xì)胞樣品凍存于- 80 ℃ 冰箱中；正式實(shí)驗(yàn)時(shí)從- 80 ℃冰箱取出細(xì)胞樣品，冰上操作，根據(jù)凍存時(shí)的細(xì)胞計(jì)數(shù)所得的細(xì)胞量加入一定體積的蛋白裂解液(100 mmol/L碳酸氫銨、8 mol/L尿素、0.2 % SDS，pH=8)，渦旋并振蕩混勻，超聲5 min使充分裂解；迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷好的1.5 mL離心管中，于4 ℃、12 000g離心15 min，取上清加入終濃度10 mmol/L DTTred于56 ℃反應(yīng)1 h，之后加入適量的IAM，于溫箱37 ℃避光孵育1 h。加入4倍體積的預(yù)冷好的丙酮于- 20 ℃環(huán)境下沉淀處理2 h，于4 ℃、12 000g至少離心15 min，收集沉淀。之后加入1 mL預(yù)冷好的丙酮重懸處理，隨后清洗沉淀樣品，于4 ℃、12 000g離心15 min，收集沉淀，風(fēng)干，最后加入一定體積的蛋白溶解液(6 mol/L尿素、100 mmol/L TEAB，pH=8.5)以溶解蛋白沉淀。

1.2.2成骨細(xì)胞總蛋白質(zhì)量控制和酶解：使用碧云天蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行BCA定量和測量蛋白樣品濃度[3]，按照試劑盒的說明書先在1.5 mL離心管中配制好BSA標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白溶液，使其濃度梯度范圍為0～ 0.5 μg/μL。按照說明設(shè)置不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和稀釋一定倍數(shù)的待測樣品試劑逐個(gè)加入96孔板中，用PBS補(bǔ)足每孔體積至20 μL，每個(gè)梯度需設(shè)置復(fù)孔3個(gè)。最后加入180 μL G250染色液工作液，室溫反應(yīng)5 min，酶標(biāo)儀上測定吸光度并在excel表格中運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算每組待測樣品的蛋白總濃度。隨后每組取40 μg樣品進(jìn)行10 % SDS-PAGE凝膠電泳，其中上層膠電泳條件為80 V跑30 min，下層膠電泳條件為110 V跑80 min；電泳結(jié)束后將條帶用考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行驗(yàn)證。為了進(jìn)行蛋白水解，在37 ℃下于2.5 μg胰蛋白酶中將100 μg蛋白質(zhì)/樣品水解4 h(蛋白質(zhì)：酶比= 40∶1)。然后以相同比例再次添加胰蛋白酶，并在37 ℃下繼續(xù)酶解8 h。接下來，使用Strata X柱將水解的肽脫鹽，并在真空下干燥。

1.2.3液質(zhì)檢測：流動(dòng)相A液體(100 %水+0.1 %甲酸)和B液(80 %乙腈+0.1 %甲酸)預(yù)配置。使用A液10 μL溶解凍干粉末，隨后4 ℃離心機(jī)中14 000g離心20 min，取上清1 μg實(shí)驗(yàn)樣品上樣，進(jìn)行液質(zhì)檢測。使用EASY-nLC 1200TM的UHPLC系統(tǒng)，預(yù)柱為自制預(yù)柱(2 cm×75 μm，3 μm)，其中分析柱為自制分析柱(15 cm×150 μm，1.9 μm)，根據(jù)試劑使用說明書操作液相色譜的洗脫程序，在Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀上機(jī)，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)(文件格式.raw)[4]。

1.2.4蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索和差異表達(dá)蛋白的功能分析：使用 Interproscan軟件進(jìn)行GO功能注釋(涉及Pfam、PANTHER、ProDom、ProSite、SMART等數(shù)據(jù)庫)，COG和KEGG對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能蛋白家族及通路分析[5]。針對具有DEPs進(jìn)行火山圖分析、聚類熱圖分析以及GO和KEGG的通路富集分析[6]，并使用STRING DB軟件[7]預(yù)測可能的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(http:// STRING.embl.de/)。

1.3 生物信息學(xué)分析

對鑒定到的蛋白進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫和亞細(xì)胞定位等常見功能數(shù)據(jù)庫注釋；針對篩選出來的DEPs結(jié)果運(yùn)用火山圖與表達(dá)聚類圖進(jìn)行整合分析，然后進(jìn)行GO功能富集、KEGG功能富集分析、DEPs亞細(xì)胞定位分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等DEPs功能分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-381-3p轉(zhuǎn)染效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

在MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染對照組(MC3-E1-NC-in)和實(shí)驗(yàn)組(MC3-E1-in)對應(yīng)的病毒，并且經(jīng)過嘌呤霉素篩選后構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證這兩組的miR-381-3p表達(dá)水平；對照組和實(shí)驗(yàn)組相比，差異倍數(shù)0.74倍(P<0.05)，證明miR-381-3p表達(dá)水平被抑制；兩組中miR-381-3p轉(zhuǎn)染效率經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證達(dá)到預(yù)期結(jié)果(圖1)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對照組MC3T3-E1細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率(*P<0.05)Fig.1 Lentiviral transfection efficiency of MC3T3-E1 cells in experimental group and control group (*P<0.05)

2.2 定量差異蛋白質(zhì)譜篩選結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)組(MC3-E1-in)組與對照組(MC3-E1-NC-in)中共篩選出了4 764種差異表達(dá)蛋白，其中527種差異顯著并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表達(dá)上調(diào)的有357種，有170種則是表達(dá)下調(diào)，見表1。對顯著DEPs繪制了火山圖，見圖2。

2.3 GO富集結(jié)果分析

為了評估所有鑒定出的蛋白質(zhì)的功能意義，使用 interproscan 軟件進(jìn)行GO注釋分析。結(jié)果顯示這些DEPs參與多個(gè)生物學(xué)過程(BP)，主要的代謝過程為細(xì)胞代謝過程、核酸代謝過程、細(xì)胞蛋白修飾過程和蛋白質(zhì)磷酸化通路；DEPs參與的主要分子功能(MF)為蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性和甲基轉(zhuǎn)移酶活性；DEPs的細(xì)胞組分(CC)分析顯示主要由細(xì)胞骨架部分、微管細(xì)胞骨架和外泌體組成；DEPs主要定位于膜的整體組分、膜上和胞質(zhì)。GO富集柱狀圖見圖3。

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜Table 1 Differentially expressed protein profile

圖2 鑒定細(xì)胞樣品中的差異蛋白火山圖Fig.2 Identify the difference protein volcano plot in the cell sample注：X軸表示蛋白質(zhì)差異(log2轉(zhuǎn)換的倍數(shù)變化)；Y軸則表示相應(yīng)的- log10轉(zhuǎn)換的P值；紅點(diǎn)表示蛋白上調(diào)顯著；綠點(diǎn)表示蛋白下調(diào)顯著；灰點(diǎn)表示沒有明顯變化的蛋白。

2.4 KEGG通路富集分析

課題組進(jìn)行了KEGG通路[8-9]分析，以進(jìn)一步表征已鑒定DEPs的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，DEPs涉及549條信號通路，差異蛋白富集結(jié)果中排名最高的20種生物學(xué)功能如圖4所示，主要通路是細(xì)胞周期通路(14種)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(9種)、Ras信號通路(7種)和過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)信號通路(6種)。在這些途徑中，“細(xì)胞周期通路、MAPK信號通路和PPAR信號通路”富含絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶PLK、脂滴包被蛋白2、Ras相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β的進(jìn)化保守信號中間物2型受體和其他蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)隨年齡增加而增加；另一方面，在本次成骨細(xì)胞樣本中檢測到的各種DEPs中也豐富了一些氧化代謝過程，尤其是一些與成骨和成肌代謝有關(guān)的過程。

圖3 所有已鑒定細(xì)胞樣品蛋白的功能性GO分類Fig.3 Functional GO classification of all identified cell sample proteins注：X軸表示GO三個(gè)大類(細(xì)胞組分、分子功能、生物過程)的富集結(jié)果；Y軸為與該GO相關(guān)的差異蛋白數(shù)目占GO注釋的所有差異蛋白數(shù)目的百分比。

圖4 差異蛋白KEGG富集的前20條途徑Fig.4 Top 20 pathways enriched by differential protein KEGG注：X軸表示富集因子(Ratio)，即注釋到每個(gè)途徑的差異蛋白的數(shù)目除以注釋到同一途徑的所有鑒定的蛋白質(zhì)；值的大小表示注釋到每個(gè)路徑的DEPs的比例大小；點(diǎn)大小代表注釋到每個(gè)路徑的差異蛋白數(shù)量。

2.5 DEPs中與SO相關(guān)的蛋白

在發(fā)現(xiàn)的DEPs中，篩選出己糖激酶2、驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白22、cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19和脂滴包被蛋白2等4個(gè)SO相關(guān)蛋白，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖5。

圖5 差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network diagram of differential proteins注：紅色和藍(lán)色節(jié)點(diǎn)分別表示DEPs上調(diào)和下調(diào)；圓圈的大小指示節(jié)點(diǎn)度。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)用Label-free定量蛋白質(zhì)組技術(shù)構(gòu)建出小鼠前成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，用T-test檢驗(yàn)對蛋白質(zhì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將實(shí)驗(yàn)組(MC3-E1-in)和對照組(MC3-E1-NC-in)之間定量差異顯著的蛋白質(zhì)(FC≥2.0，同時(shí)P≤0.05時(shí)，標(biāo)記為上調(diào)表達(dá)蛋白；當(dāng)FC≤0.50，同時(shí)P≤0.05時(shí)，標(biāo)記為下調(diào)表達(dá)蛋白) 定義為DEPs。結(jié)合文獻(xiàn)梳理結(jié)果并初步篩選出己糖激酶2、驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白22、cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19和脂滴包被蛋白2等OP相關(guān)蛋白，分析這些DEPs，緊密結(jié)合課題組前期SO高通量測序發(fā)現(xiàn)肌肉和骨組織樣品中顯著差異表達(dá)miR-381-3p等臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，并通過本項(xiàng)目的細(xì)胞層面蛋白質(zhì)組學(xué)研究為進(jìn)一步闡明SO的內(nèi)在分子機(jī)制提供更多基礎(chǔ)研究依據(jù)。

己糖激酶2(hexokinase-2，HK2)在正常的機(jī)體骨代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，國內(nèi)外研究者研究發(fā)現(xiàn)，HK2不僅在糖酵解中起重要作用，而且在細(xì)胞存活中也起重要作用；Miyamoto 等[10]研究發(fā)現(xiàn)HK2是骨骼肌和脂肪組織等胰島素敏感組織中的主要同工型的酶，其上調(diào)表達(dá)有助于自噬反應(yīng)，其機(jī)制可能是HK2充當(dāng)從糖酵解到自噬的分子轉(zhuǎn)換，以確保機(jī)體在一定條件下的細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)，以實(shí)現(xiàn)保護(hù)肌細(xì)胞的目的。

驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白22(kinesin-like protein 22，KIF22)屬于微管依賴性分子運(yùn)動(dòng)蛋白，可與微管和染色體結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞器，蛋白質(zhì)和mRNA[11]。郭曉強(qiáng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)樣蛋白作為重要地的分子馬達(dá)，其重點(diǎn)調(diào)控肌肉細(xì)胞和非肌肉細(xì)胞的機(jī)體運(yùn)動(dòng)，此外，驅(qū)動(dòng)樣蛋白可與動(dòng)力蛋白搭配后沿著微管運(yùn)動(dòng)在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸，其在細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)以及減數(shù)分裂中染色體分離過程充當(dāng)重要角色[13]；Faire等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)在成肌分化過程中，許多細(xì)胞器會(huì)重新定位，并在肌管的整個(gè)生命周期內(nèi)保持不對稱分布，而驅(qū)動(dòng)樣蛋白超家族的成員可能負(fù)責(zé)這些微管依賴性運(yùn)動(dòng)中的一些或全部，在研究者后續(xù)鑒定過程中同樣證實(shí)了驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白在所有階段的成肌細(xì)胞中以及在各種大鼠組織中普遍表達(dá)。在小鼠前成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對照組對比中發(fā)現(xiàn)KIF22處于高表達(dá)水平，提示驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白22可能作為有效轉(zhuǎn)錄因子參與老年性肌肉-骨骼系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過程。

Yoshikawa等[15]在鑒定大鼠骨骼肌的失神經(jīng)萎縮差異基因表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19(cAMP-regulated phosphoprotein 19，ARPP19)處于高表達(dá)水平。眾所周知，cAMP對L-型鈣通道功能具有重要的調(diào)控作用。李芳萍[16]研究成骨細(xì)胞Ros 17/2.8中肌動(dòng)蛋白對cAMP調(diào)節(jié)的L-型鈣通道的作用及其分子機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白可以通過改變L-型鈣通道動(dòng)力學(xué)特征以調(diào)節(jié)L-型鈣通道的活性, 研究者深入研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體肌動(dòng)蛋白狀態(tài)可以顯著影響L-型鈣通道的功能，而cAMP可以介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白4與L-型鈣通道的相互作用來調(diào)控L-型鈣通道的功能。

脂滴包被蛋白2(perilipin-2，Plin2)是一種與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴(LDs)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)[17]，其過表達(dá)會(huì)影響肌肉減少癥、骨質(zhì)疏松癥等多種代謝和與年齡有關(guān)的疾病的進(jìn)程，這表明該蛋白可能在這些病理狀態(tài)下起作用；Conte等[18]的研究則在老年人和不運(yùn)動(dòng)的人群中發(fā)現(xiàn)了Plin2與較低的肌肉質(zhì)量和力量之間的密切關(guān)系，但其在骨骼肌中的功能仍不清楚，Conte等研究者通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究了Plin2在肌肉中的作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Plin2是控制肌肉質(zhì)量的關(guān)鍵介質(zhì)。Vasuri F等[19]的研究發(fā)現(xiàn)Plin2表達(dá)隨年齡增長而增加，以Plin2包被的脂質(zhì)滴形式存在于骨骼肌中的脂肪沉積會(huì)隨著年齡的增長而增加，并且與肌肉強(qiáng)度和厚度的降低有關(guān)，其機(jī)制可能是通過IGF-1和p53依賴性調(diào)控的[20]。

本研究采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)并結(jié)合文獻(xiàn)閱讀篩選出己糖激酶2、驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白22、cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19和脂滴包被蛋白2等可能在miR-381-3p介導(dǎo)肌-骨系統(tǒng)代謝過程起到調(diào)控作用的特異性靶蛋白。課題組后續(xù)研究將綜合miR-381-3p在成肌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)，綜合分析miR-381-3p在成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系以便發(fā)現(xiàn)肌少-骨質(zhì)疏松癥密切聯(lián)系的共同轉(zhuǎn)錄因子。并且在本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上課題組后續(xù)開展重要靶蛋白與相關(guān)的信號通路信息的干預(yù)處理及機(jī)制分析，針對有特定意義的蛋白將通過動(dòng)物基因敲除及細(xì)胞層面的熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證，以更好地說明所鑒定到的靶蛋白在研究肌少-骨質(zhì)疏松癥疾病發(fā)生、發(fā)展中的意義。