咬合支持改變對幼年大鼠骨代謝及骨微結構的影響

劉艷飛 李伯琦 陳朝旭 劉奕杉*

1.新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院)兒童口腔科-口腔預防科，新疆 烏魯木齊 830054 2.新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所，新疆 烏魯木齊 830054

近年來，人們越來越關注口腔疾病對全身健康的影響。牙齒脫落，冠、橋或假牙的垂直尺寸不足引起的咀嚼功能障礙會對身體、心理、生活質量產生影響。大量研究表明[1-2]，咀嚼功能障礙作為慢性應激源會激活下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary- adrenal，HPA)軸，導致循環糖皮質激素(glucocorticoid，GC)水平升高并引發各種疾病，如海馬依賴性認知缺陷。由于GC被認為是“應激”的標志，因此咬合不協調會導致機體產生一定的壓力。眾所周知，過量接觸GC會導致骨質減少。例如兒童使用類固醇藥物治療相關疾病，如哮喘和皮膚過敏，通常對骨骼有不良反應，包括骨折和骨骼生長減慢[3]。鑒于應激誘導的激素對骨代謝的顯著影響，有必要評估咬合支持改變引起的應力對骨組織的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

由新疆醫科大學動物實驗中心提供的SPF級健康4～5周齡SD大鼠18只(雄性)，體重50～60 g，動物倫理審查批號(2016D01C316)，適應性飼養一周，自由進食水，隨機分為3組。

1.2 主要試劑和儀器

注射水合氯醛、PBS鹽酸緩沖液(上海中杉金橋)，4%多聚甲醛緩沖液，CRH、ACTH、CORT、BGP、TRACP-5試劑盒(上海江萊)、5%EDTA脫鈣液、HE染色劑、移液器、小號止血鉗、光學顯微鏡(德國萊卡)、蠟切片機、顯微采片石、生物組織自動包埋機(德國萊卡)。

1.3 模型建立

所用實驗組動物均用水合氯醛(35 mg/100 g)腹腔注射麻醉，A組不拔牙，B組拔除單側磨牙，C組同時拔除雙側磨牙，實驗組用小號止血鉗拔除磨牙，術中動作輕柔，盡量拔除完整牙齒，若牙冠折斷、去除可見牙體組織，消除后牙咬合，壓迫止血后，常規顆粒飼料喂養，觀察大鼠一般情況及體重情況。

1.4 標本制備

造模后4周尾巴采血及8周后麻醉狀態下腹主動脈(采血時間20：00)，4 ℃靜置2 h、3 000 r/min離心 15 min，分離血漿，分裝于EP 管，-80 ℃冷凍保存備用；采血致死后迅速剝離股骨并用生理鹽水沖洗置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol、pH=7.4)中固定48 h，左側股骨EDTA脫鈣后常規石蠟包埋，切4 μm厚骨組織切片標本，每只取5張連續切片置于載玻片進行HE染色；右側股骨置入PBS緩沖液中行Micro-CT掃描。

1.5 指標檢測和方法

按試劑盒說明，采用ELISA法檢測血漿CRH、ACTH、CORT、BGP和TRACP-5b的表達。通過HE染色，光學顯微鏡下觀測大鼠股骨組織病理學改變。影像學檢測，以17.96 μm分辨率掃描大鼠右側遠端股骨，管電流為280 μA，管電壓為80 kV，曝光時間為280 ms，旋轉角度0.5 deg，掃描完成后，將Micro-CT數據傳到工作站，感興趣區域是距離股骨遠端的生長板0.5～2 mm處100片切片進行三維重建以及對骨小梁三維微結構參數進行測量。測量參數包括骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(TB.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.6 統計學處理

應用 SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，實驗結果以均數±標準差做統計描述。多組間比較應用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用 LSD 檢驗(方差齊性)和 Tamhane’s T2 檢驗(方差不齊)，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重情況

術后1 d大鼠正常顆粒飲食，毛發正常，拔牙前、術后4周和8周的大鼠各組間體重差異無統計學意義(P<0.05)，進一步兩兩比較任意兩組間差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 三組大鼠不同時間體重比較

2.2 ELISA檢測HPA軸相關激素水平

隨著咬合支持改變加重，大鼠血漿中CRH、ACTH、CORT表達呈上升趨勢，三組大鼠表達差異有統計學意義(P<0.001)，進一步兩兩比較大鼠血漿中CRH、ACTH、CORT的表達，任意兩組間差異均有統計學意義(P<0.001)，詳見表2。

2.3 ELISA檢測骨代謝相關激素水平

隨著咬合支持改變加重，大鼠血漿BGP呈顯著下降趨勢，TRACP-5b的表達呈下降趨勢；三組大鼠血漿中BGP的表達差異有統計學意義(P<0.05)，TRACP-5b的表達差異無統計學意義(P>0.05)；進一步兩兩比較，BGP任意兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)；TRACP-5b任意兩組間差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3。

表2 三組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT水平比較Table 2 Serum CRH, ACTH, CORT levels in three groups (ng/mL,

表3 三組大鼠血漿BGP、TRACP-5b水平

2.4 HE染色結果顯示

隨著咬合支持改變加重，大鼠股骨呈現不同的組織學改變，A組股骨骨小梁組織形態結構正常，無明顯病理性改變；B、C兩組大鼠骨小梁變細、數量明顯減少，排列疏松；C組甚至斷裂，骨小梁結構出現較多大的空白區域，詳見圖1。

圖1 三組大鼠股骨骨組織變化(HE 染色×100)Fig.1 Changes of the femoral bone tissue in rats (HE staining, ×100)

2.5 Micro-CT檢測大鼠股骨結果

隨著咬合支持改變加重，大鼠股骨骨小梁體積分數(BV/TV)、小梁數(Tb.N)和小梁厚度(Tb.Th)呈降低趨勢，骨小梁分離度(Tb.Sp)呈升高趨勢；三組差異有統計學意義(P<0.01)。進一步兩兩比較，任意兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見圖2、3。

圖2 大鼠各組股骨骨組織微結構變化(Micro-CT)Fig.2 Microstructural changes of the femoral bone in each rat group (micro-CT)

圖3 三組大鼠股骨骨小梁BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp的比較Fig.3 Comparison of trabecular BV/TV, Tb.N, Tb.Th, and Tb.Sp of the femur among the three groups注：*P<0.05。

3 討論

HPA軸是一條直接作用與反饋互動的復雜集合的神經內分泌軸，參與控制應激反應，以維持人體內環境穩定[4]。HPA軸保持穩態的機制廣泛依賴于幾個關鍵調節分子的釋放和攝取，應激信號沿神經中樞傳入下丘腦室旁核，會引起促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)的釋放，CRH通過垂體門靜脈系統促進垂體前葉合成、分泌促腎上腺皮質激素(adrenocoticotropic hormone，ACTH)，后者可誘導腎上腺皮質束狀帶-網狀帶合成和釋放GC使機體發生防御反應，GC人體中主要為皮質醇(cortisol，COR)，嚙齒動物主要為皮質酮(corticosterone，CORT)，這些循環皮質類固醇調節大量生理過程，并且還負責激活腦內的糖皮質激素受體(glucocorticoid recepor，GR)來啟動HPA軸上的負反饋環路，抑制皮質類固醇的過度產生。然而，重復或延長的HPA軸活動會持續增加循環GC水平循環，過多的GC會破壞HPA軸的負反饋系統，進一步增強了GC的分泌[5]。造模后實驗組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT水平顯著增加，這與暴露于各種慢性壓力如束縛、強迫游泳、噪聲、擁擠、社會環境等導致嚙齒類動物中的應激激素皮質酮水平持續升高[6-7]相一致，因此大鼠長期咬合不調可作為慢性壓力使機體產生應激反應，與此同時，本研究發現咬合支持完全喪失對大鼠HPA軸活動影響最大。

骨骼是GC的受體之一，在生理劑量下通過未成熟和成熟成骨細胞在早期骨骼中起作用；而超生理劑量的糖皮質激素則會影響成骨細胞、骨細胞和破骨細胞，從而影響骨骼的發育[8]。目前認為BGP是反映機體的骨組織形成重要指標、TRACP-5b是骨吸收和破骨細胞活性的重要標志物[9-11]。SD大鼠在3～4月齡時骨形成和骨吸收活躍程度最高，骨量達到峰值[12]。與對照組相比，隨著咬合不調程度的加重，大鼠股骨血漿中BGP隨之降低，TRACP-5b隨之輕微升高，這說明大鼠咬合不調影響了骨代謝，循環中升高的CORT抑制了成骨細胞功能，而TRACP-5b輕微的增加可能與成骨細胞和骨細胞對破骨細胞募集和活化有關[13]。HE結果顯示實驗組骨小梁數量減少、變細，而雙側磨牙缺失(C)組病理學改變較嚴重出現了較多空白區域，Micro-CT結果顯示與對照組(A)相比，B和C組BV/TV分別降低了13.4%和23.8%，Tb.N分別降低了28.2%和58.9%，Tb.Th分別降低了9.9%和20.2%，Tb.Sp分別升高了12.4%和26.4%，這可能是由于循環中CORT的升高抑制成骨細胞的骨形成進而使骨轉換降低影響骨穩態導致骨量減少、骨形態改變。

大鼠一般情況正常，三組大鼠在每日食物攝入量和總體營養狀況方面無任何顯著差異。與對照組相比實驗組體重稍降低，但差異無統計學意義，這與其他研究結果[2]一致。據報道，體重增加或減少10%以內對骨量幾乎沒有影響[14]。因此，體重不是其主要影響因素。

綜上所述，幼年大鼠長期咬合不調作為慢性應激源異?；罨疕PA軸，持續增加循環CORT水平。升高的CORT對成骨細胞的代謝及分子信號通路有負面影響，破壞成骨細胞和破骨細胞的動態穩定，體現在骨小梁形態學改變及骨質丟失。此外，通過對咬合支持改變對幼年大鼠股骨骨小梁的影響研究的結果發現咬合完全喪失對骨小梁影響更嚴重。臨床中加強對缺失牙的修復及咬合調整是否會緩解對骨質的影響尚可未知，有待進一步研究。