左、右歸丸對去卵巢大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

馮秀芝 吳繼雷 藥曉雨 任艷玲*

1. 遼寧中醫藥大學中醫學院，遼寧 沈陽 110847 2. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

現代醫學對絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發病機制研究逐步深入，可概括為骨代謝穩態失衡。根據中醫學腎之精氣、陰陽理論，女性在絕經后，腎精虧虛，天癸竭絕，加之陰陽關系失衡，出現骨髓空虛，任物無力。左歸丸和右歸丸是明代張景岳創制的經典名方，用藥注重陰陽既濟，能顯著改善PMOP患者血清學和組織學指標。前期實驗研究也證實左、右歸丸能促進PMOP大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化，然而作用機制尚不十分明確。AMP(adenosine 5'-monophosphate ) 依賴的蛋白激酶(AMPK)是生物能量代謝調節的關鍵分子，是細胞內最重要的能量感受器，對維持細胞的能量平衡具有關鍵調節作用，幾乎參與細胞所有的生長代謝活動，是研究代謝性疾病的核心。本研究將基于AMPK/mTOR信號通路探討左、右歸丸對去卵巢大鼠BMSCs成骨分化的影響，以期闡明左、右歸丸治療PMOP的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級2月齡雌性大鼠60只，體質量180～220 g，購買于遼寧長生生物技術有限公司，經營許可證號為SCXK(遼)2015-0001。

1.1.2藥物組成：實驗過程中所用中藥飲片均購自遼寧中醫藥大學附屬醫院。左歸丸方劑組成：熟地黃24 g、山萸肉12 g、麩炒山藥12 g、枸杞12 g、牛膝9 g、菟絲子12 g、龜甲膠12 g、鹿角膠12 g(《中藥部頒標準》)；右歸丸方劑組成：熟地黃24 g、麩炒山藥12 g、山萸肉12 g、枸杞12 g、菟絲子12 g、黑順片6 g、肉桂6 g、當歸9 g、杜仲9 g、鹿角膠12 g(《中華人民共和國藥典》2015版·第一部)。將上述藥方用蒸餾水煎煮，制成濃縮煎劑。補佳樂(戊酸雌二醇片，生產企業：DELPHARM Lille S.A.S.藥品批準文號：國藥準字J20171038)研磨成粉末狀，加入蒸餾水，按照一定體積制成混懸液。

1.1.3儀器與試劑：倒置顯微鏡(Leica，美國)，二氧化碳恒溫培養箱(Thermo，美國)，流式細胞儀(BD，美國)，紫外可見分光光度計，生物安全柜(Thermo，美國)；改良型α-MEM培養液(HyClone)，胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015，德國)，0.25 %胰蛋白酶(Sigma)，APC anti-mouse/rat CD29，PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90/mouse CD90.1 (Thy-1.1) Antibody，PE anti-rat CD11b/c ，PE/Cy7 anti-rat CD45 Antibody，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(Solarbio，貨號BC2142)等。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及處理方案：將60只2月齡雌性SPF級SD大鼠隨機分為6組，分別為空白組(KB)、假手術組(SHAM)、模型組(OVX)、補佳樂組(BJL)、右歸丸組(YGW)、左歸丸組(ZGW)，每組10只。于動物實驗中心(室溫20 ℃～25 ℃，濕度30 %～35 %)適應性喂養7 d后，除KB組和SHAM組外，進行雙側卵巢摘除術，SHAM組模擬手術過程，僅摘除卵巢附近少許脂肪組織，KB組不做處理，術后3 d開始灌胃給藥。根據“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”，換算得出各給藥組以成人給藥量的6.3倍(以單位體重計)劑量進行灌胃給藥，具體如下：BJL組、YGW組、ZGW組分別按照0.09 mg/kg、10.26 g/kg、9.45 g/kg的灌胃量給藥，生藥量為1 g/mL。SHAM組和OVX組以1 g/kg蒸餾水灌胃，每日1次，灌胃12周。

1.2.2骨髓間充質干細胞分離培養及成骨分化誘導:以上述方案灌胃12周后，取大鼠股骨與脛骨BMSCs進行培養，以差時貼壁法得到大鼠原代BMSCs，待原代細胞融合至85 %～90 %時進行首次傳代，于第三代進行細胞鑒定并加入成骨分化誘導液繼續培養，9 d后進行相關實驗。取材具體操作方案及成骨分化誘導液組成與前期實驗相同[1]。

1.2.3BMSCs鑒定：取生長期細胞觀察細胞形態；將P3代細胞濃度調整為1×105/mL，分別加入APC anti-mouse/rat CD29、PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90、PE anti-rat CD11b/c ，PE/Cy7 anti-rat CD45，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.4ALP活性檢測：用堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒測定各組ALP活性。取成骨誘導10 d細胞培養上清液，4 ℃、10 000 r/min 離心8 min，取上清液待測。按試劑盒操作步驟將相應試劑和待測樣品按順序混勻，并設空白孔和標準孔，于 510 nm 處測定吸光度，計算各組堿性磷酸酶活性。

1.2.5BMSCs成骨誘導后礦化結節的觀察：取P3代細胞經胰酶消化后以5×107/L接種于24孔板，以成骨誘導液培養9 d后棄培養液，以PBS清洗2次，以乙醇(95 %)固定10 min，PBS清洗3次后進行茜素紅染色，自來水沖洗并常溫干燥后于顯微鏡下觀察礦化結節的形成。

1.2.6Runx 2蛋白、AMPK /mTOR信號通路相關蛋白檢測：取成骨誘導液培養9 d細胞，以PBS清洗3次，甩干，將細胞刮至一角，每瓶(25 cm2)細胞加入100 μL細胞裂解液，冰上靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清；配制SDS-PAGE分離膠，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣25 μL，電泳后用半干法進行轉膜3 h，封閉液封閉后，Ⅰ抗(稀釋比：Runx 2、p70S6K1、p-p70S6K1為1∶500，AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR為1∶1 000)37 ℃孵育1 h，4 ℃過夜后，用TBST溶液清洗5次，置Ⅱ抗孵育液中37 ℃孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，暗室加入ECL發光液，曝光，掃描圖像，檢測條帶灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白(β-actin)條帶的吸光度比值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 BMSCs形態學觀察

原代細胞培養24 h后少量細胞貼壁，呈透亮圓形，3 d后貼壁細胞增多，5 d后進行首次換液，貼壁細胞形成許多突觸，細胞呈多角形、扁長的菱形或梭形，傳代后細胞融合，呈長梭形，可見旋渦狀分布。見圖1。

圖1 BMSCs倒置顯微鏡下形態Fig.1 The morphology of BMSCs under an inverted microscope注：A：P2代2 d，B：P3代4 d。

圖2 BMSCs流式細胞儀鑒定結果Fig.2 Flow cytometry identification results of BMSCs

2.2 BMSCs的流式細胞儀鑒定結果

P3代細胞經流式細胞儀檢測細胞表面抗原，結果是APC anti-mouse/rat CD29和PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90呈陽性，陽性率分別是99.7 %和99.5 %；PE anti-rat CD11b/c和PE/Cy7 anti-rat CD45呈陰性，陰性率分別是3.3 %和1.2 %。見圖2。

2.3 左、右歸丸對去卵巢大鼠BMSCs ALP活性的影響

實驗結果顯示，KB組與SHAM組比較，ALP活性無顯著性差異(P>0.05)；OVX組與SHAM組比較，ALP活性明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，三個用藥組均能提高ALP活性，有顯著性差異(P<0.05)；三個用藥組比較，ZGW組提高ALP活性作用最明顯，BJL組與YGW組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.4 左、右歸丸對去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導后礦化結節的影響

與KB組比較，OVX組礦化結節數量明顯減少；與OVX組比較，三個用藥組礦化結節數量明顯增多，且ZGW組優于YGW組，YGW組優于BJL組。見圖3。

表1 各組BMSCs成骨誘導后ALP活性

圖3 左、右歸丸對BMSCs成骨誘導后茜素紅染色礦化結節形成的影響Fig.3 Effect of Zuo and Yougui Pills on the formation of mineralized nodules by alizarin red staining after osteoinduction of BMSCs

2.5 左、右歸丸對去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導后Runx 2蛋白表達的影響

與KB組比較，OVX組Runx 2蛋白表達水平下降，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，各用藥組Runx 2蛋白表達水平均有不同程度的升高，說明各用藥組均能促進去卵巢大鼠BMSCs的成骨分化，有顯著性差異(P<0.05)，其中BJL組和ZGW組優于YGW組，BJL組和ZGW組無顯著性差異。見圖4。

圖4 左、右歸丸對BMSCs成骨誘導后Runx2蛋白表達水平的影響Fig.4 The effect of Zuo and Yougui pills on the expression of Runx2 protein after BMSCs osteoinduction注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05；與YGW組比較，△P<0.05。

2.6 左、右歸丸對去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導后AMPK/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

與KB組比較，OVX組AMPKα蛋白磷酸化水平升高，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，各用藥組AMPKα蛋白磷酸化水平均有不同程度的降低，有顯著性差異(P<0.05)；與BJL組比較，ZGW組和YGW組AMPKα蛋白磷酸化水平降低，有顯著性差異(P<0.05)；ZGW組和YGW組比較無顯著性差異。見圖5。

與KB組比較，OVX組mTOR蛋白磷酸化水平降低，有顯著性差異(P<0.01)；與OVX組比較，三個用藥組mTOR蛋白磷酸化水平升高，有顯著性差異(P<0.05)；三個用藥組相比，BJL組和ZGW組mTOR蛋白磷酸化水平高于YGW組，有顯著性差異(P<0.05)，BJL組與ZGW組相比無顯著性差異。見圖6。

與KB組比較，OVX組p70S6K1蛋白磷酸化水平降低，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，各用藥組p70S6K1蛋白磷酸化水平均有不同程度的升高，有顯著性差異(P<0.05)；三個用藥組相比，BJL組與YGW組無顯著性差異，ZGW組p70S6K1蛋白磷酸化水平明顯高于BJL組和YGW組，有顯著性差異(P<0.05)。見圖7。

圖5 左、右歸丸對BMSCs成骨誘導后AMPKα蛋白磷酸化水平的影響Fig.5 The effect of Zuo and Yougui pills on AMPKα protein phosphorylation after osteoinduction of BMSCs注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05。

圖6 左、右歸丸對BMSCs成骨誘導后mTOR蛋白磷酸化水平的影響Fig.6 The effect of Zuo and Yougui pills on the phosphorylation level of mTOR protein after osteoinduction of BMSCs注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05；與YGW組比較，△P<0.05。

圖7 左、右歸丸對BMSCs成骨誘導后p70s6k1蛋白表達水平的影響Fig.7 The effect of Zuo and Yougui pills on the expression of p70s6k1 protein after osteogenic induction of BMSCs注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05；與YGW組比較，▽P<0.05。

3 討論

現代醫學認為女性絕經后雌激素水平的驟然下降是PMOP發生的主要原因，動物實驗研究和臨床研究皆顯示外源性雌激素或雌激素受體調節劑能通過多種作用機制抑制破骨細胞活性、提高成骨細胞的骨形成作用，提高骨密度，從而有效防治PMOP。但雌激素治療會帶來許多副作用，如增加子宮內膜增生、冠狀動脈疾病和靜脈血栓栓塞等的發病風險[2]。中醫學認為PMOP以腎精虧虛為本，繼之陰陽失衡，“陽化氣、陰成形”功能失調，從而出現相關的病機變化和臨床癥狀，中醫藥防治PMOP有確切的臨床療效[3]。左、右歸丸為PMOP(骨痿)中醫藥診療指南(2019年版)推薦用藥[4]。左、右歸丸基于“精不足者，補之以味”“陰陽既濟”立法，其中左歸丸以滋補腎之陰精為主，輔之以溫陽；右歸丸以溫補腎陽為主，輔之以滋陰。“陽化氣，陰成形”高度概括了陰陽之功能，陽氣主動，在機體生長壯老已的新陳代謝活動中主要發揮氣化推動作用；陰精主靜，構成有形物質本身，并主有形物質的化生。左、右歸丸通過補腎填精，或以滋補陰精為主，輔以溫陽，陽中求陰，或以溫補腎陽為主，輔以滋陰，陰中求陽，以期陰陽互濟，糾正PMOP陰陽功能失衡的病理狀態。

AMPK/mTOR信號通路是細胞能量代謝的調控樞紐，對細胞的生長代謝活動具有極其重要的意義。mTOR即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，在細胞的生長、增殖調節中起關鍵作用[5]。AMPK是細胞內的能量感受器，被激活后通過磷酸化TSC2、抑制mTOR信號通路從而抑制細胞的合成代謝和細胞生長，而上調細胞分解代謝相關基因，增強細胞的自噬水平，從而促進細胞能量產生，減少能量消耗，恢復AMP/ATP比值，以適應內外環境的變化[6-9]。文獻研究[10-11]顯示，激活AMPK能明顯抑制BMSCs的成骨分化，但亦有相反狀況。也有研究[12]顯示過度激活AMPK能促進MC3T3-E1細胞的成骨并通過AMPK-Gfi1-OPN軸抑制3T3-L1細胞的成脂。一項糖尿病相關的骨丟失機制的研究[13]發現在沒有Mst1/2激酶的情況下，葡萄糖轉運蛋白Glut1的表達會丟失，并導致AMPK的激活和Runx2蛋白酶體的降解。另一方面有研究[14]提示AMPK的激活對成骨分化的促進或抑制作用與時間相關，顱骨成骨細胞和MC-3T3細胞在分化早期表達激活的AMPK，但是持續性激活的AMPK則會抑制成骨分化；他們的后續研究發現成骨分化的早期需要激活AMPK，促進分解代謝保證分化早期成骨細胞的能量需求，但在第9天后則需要下調AMPK的磷酸化，以滿足分化后期合成代謝的需要。也有研究者[15]認為骨代謝與能量代謝之間具有更為復雜的關系，而不是簡單的促進或抑制。因此，AMPK的激活對成骨分化的具體影響及其機制還有待于進一步研究。

前期研究[16-18]結果顯示，左、右歸丸能有效干預PMOP大鼠BMSCs的成骨與成脂分化平衡，二者均能促進PMOP大鼠BMSCs的成骨分化，且左歸丸優于右歸丸；二者均能抑制BMSCs的成脂分化，并且與TGF-β/Smad以及Smad-ERK信號級聯有關。本課題體內動物實驗研究結果顯示，與KB組比較，OVX組大鼠腰椎骨密度明顯降低，骨組織形態改變，骨小梁數量減少，排列紊亂，骨髓腔增大；左、右歸丸能增加PMOP大鼠腰椎骨質密度，改善PMOP大鼠股骨組織形態，以左歸丸效果最為明顯；左、右歸丸能影響OVX大鼠的脂質代謝、脂肪組織分布及形態，以右歸丸效果更明顯；左、右歸丸對PMOP大鼠骨髓組織PICP、OPG、TRAP、RANKL等骨代謝指標均有不同程度的影響，上述影響皆與AMPK/mTOR信號通路有關[19-21]。體外細胞實驗研究結果顯示，左、右歸丸能提高去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導后ALP活性，明顯增加其成骨誘導后礦化結節的形成，并能提高其Runx 2蛋白的表達水平，因此，左、右歸丸能促進去卵巢大鼠BMSCs的成骨分化，改善成骨誘導后的骨形成指標，以左歸丸效果更佳，其中的作用機制可能是通過AMPK /mTOR信號通路參與了BMSCs的成骨分化。對實驗結果進行分析得出OVX組AMPKα蛋白的磷酸化水平較KB組顯著升高，mTOR信號通路相關蛋白磷酸化水平則降低，激活了細胞的能量代謝過程，抑制了細胞的合成代謝。左、右歸丸均能降低AMPKα蛋白的磷酸化水平，從而激活mTOR信號通路，提高mTOR和p70S6K1蛋白的磷酸化水平。因此左、右歸丸可能通過AMPK/mTOR信號通路抑制細胞的分解代謝，促進其合成代謝，提高BMSCs的成骨分化能力，增強成骨細胞的成熟、功能和活性，從而調整BMSCs的骨脂分化平衡。

綜上所述，左歸丸在影響PMOP大鼠BMSCs的骨脂分化平衡方面效果優于右歸丸，而右歸丸在調節PMOP大鼠脂質代謝方面的作用優于左歸丸，近年來，骨髓脂肪組織在骨質疏松癥中發揮的作用正引起人們的關注，右歸丸防治PMOP的作用機制除了影響BMSCs的骨脂分化平衡外，對骨髓脂肪組織的形成及生物學調控作用的影響將是下一步的研究方向。