魚類生長分子標記的研究進展

李文文，王炳謙，黃天晴，谷偉，劉恩慧，劉洋，姜再勝，徐革鋒

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，農業農村部淡水魚生物技術與養殖重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150010；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 200120；3.安徽省宣城水產技術推廣站，安徽 宣城 201306）

魚類是重要的經濟生物，為人們生活提供優質的動物蛋白。提高養殖魚的生長性能、優化生長性狀不僅可以縮短養殖時間、節約養殖成本，還能增加產量，滿足人們的食物需求。魚類的生長性狀是多因素調控的復雜性狀，不僅受環境因素影響，還受生長性狀相關基因的決定。近年來分子標記技術的發展為優化魚類生長提供了理論基礎和技術支持。

1 分子標記技術的原理和主要方法

分子標記是繼形態標記、細胞標記和生化標記后興起的一種新的遺傳標記形式[1,2]。常說的分子標記是指狹義的分子標記，即DNA 序列標記[3]。自中心法則發現以來，核酸、蛋白質等生物大分子在決定生物性狀上扮演著重要角色，分子標記作為深入了解遺傳學的重要工具，與下一代測序技術結合，極大地豐富了育種策略[4]。隨分子生物學的發展，分子標記技術也不斷更新，迄今為止已經歷三次革新，第一代分子標記技術包括限制性長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技術、隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術、擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術；第二代分子標記包括簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標記和內部簡單重復序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR）標記；第三代分子標記包括單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）標記和表達序列標簽（Expressed Sequence Tags，EST）標記[2]。

1.1 第一代分子標記技術

1.1.1 RFLP 標記技術

1980 年Botesin 最早將RFLP 用作DNA 遺傳標記，通過檢測酶切后同源DNA 片段長度的差異反映DNA 分子的微小變化，不受環境影響，呈孟德爾共顯性遺傳，可區分純合和雜合基因型，穩定性高，重復性好；然而，其只能酶切特定的位點表現其多態性，靈敏度不高，限制了RFLP 技術的應用[2,5,6]。

近年來，RFLP 標記技術與PCR、電泳技術完美結合[5]；通過連鎖標記定位目的基因，在水產生物遺傳育種中發揮著重要作用。利用RFLP 標記，張四明等[7]研究長江中游的鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和草魚（Ctenopharyngodon idella）mtDNA 的遺傳結構變異；董傳舉等[8]對鱘（Acipenser sinensis）線粒體進行PCR-RFLP 以區分混合池的不同養殖對象。

1.1.2 RAPD 標記技術

RAPD 標記是基于PCR 技術、利用隨機短脫氧核苷酸單鏈為引物，擴增后的DNA 片段經電泳分離、染色后檢測其多態性[5]。RAPD 擁有PCR 技術的所有優點，能夠大量篩選出基因位點，常被用于魚類的遺傳育種、種質鑒定、種群結構分析、遺傳多樣性分析、疾病治療等[9]。該技術操作便捷、安全性好，彌補了RFLP 的不足，但RAPD 表現為孟德爾顯性遺傳，不能識別雜合位點，實驗重復性較差[2]。

Ebtsam 等[10]從克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）體內分離出株絲孢菌并對毒力因子進行RAPD 檢測，證實了該種真菌對小龍蝦的致病性，進而感染其他生物，對微生物疾病防治起到一定的指導意義；Yao 等[11]通過PCR-RAPD 擴增金槍魚（Thunnini）Cyt-b 基因，用于區分制作刺身的金槍魚種與誤用種黃鰭金槍魚（Thunnus albacores）、藍鰭金槍魚（Thunnus thynnus）、大眼金槍魚（Thunnus obesus）、大西洋藍鰭金槍魚（Thunnus thynnus）和長鰭金槍魚（Thunnus alalunga）、鰹（Katsuwonus pelamis）、條紋四鰭旗魚（Tetrapturus audax），及劍魚（Xiphias gladius）的遺傳差異。

1.1.3 AFLP 標記技術

AFLP 是近些年興起的基于PCR 技術的多位點標記技術，在PCR 引物的3’端添加堿基，延伸過連接位點并進入DNA 片段，引物序列正確時進行退火[9]。少量的引物就可以檢測出大量位點，成本較低，遺傳穩定性好，多態性豐富，為水產動物的親緣關系鑒定、多態性位點分析、遺傳多樣性、基因的表達與調控等研究提供了行之有效的方法[2,5]。

利用AFLP 標記技術，袁文華[5]對不同多鱗（Sillago sihama）群體進行遺傳多樣性分析并構建遺傳圖譜，為其人工育種提供合理的指導策略；Felip等[12]利用486 對引物在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）Y 染色體上鑒定出11 個性別相關標記，為進一步分析性別基因座提供了實驗基礎。

1.2 第二代分子標記技術

1.2.1 SSR 標記技術

SSR 是由幾個（通常為2～6 個）核苷酸為單位組成的串聯重復序列，常見的為雙核苷酸重復（CA）n和（AT）n[2,9,13]。SSR 可以作為RFLP 的探針，為孟德爾共顯性遺傳，一個DNA 芯片可以同時檢測出基因組中的多個變異位點，遺傳方式簡單、DNA 用量少、檢測迅速，具有豐富的多態性，已被廣泛用于各類物種基因定位及克隆、疾病診斷、親緣關系分析及品種鑒定、遺傳育種以及進化等研究[2,13]。

Han 等[14]在梭鱸（Sander lucioperca）轉錄組共檢測到16 368 個SSR，隨機選擇300 個進行擴增，檢測成功率高達87%，為梭鱸轉錄組學研究奠定基礎；Henry 等[13]在超級雌性半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中鑒定出206 bp DNA 條帶，證明了半滑舌鰨ZW 性別決定機制，為全雌魚繁育提供了重要的依據。

1.2.2 ISSR 標記技術

ISSR 是在SSR 的3'或5'端加上2～4 個核苷酸作為引物，對間隔重復序列進行擴增的新興標記技術[2]。與SSR 相比，ISSR 無需知道基因組序列，設備簡單、重復性好、靈敏度高，常被用來評估群體遺傳變異[15]。

Liu 等[16]利用12 個不同的ISSR 引物對牙鲆（Paralichthys olivaceus）3 個群體篩選，發現與普通群體相比，感病和抗性群體存在明顯的遺傳差異，對牙鲆資源的保護具有深遠的意義；Saad 等[17]鑒別四種羅非魚時發現奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）和吉利慈鯛（Tilapia zillii）遺傳差異最大，而尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）和奧利亞羅非魚的遺傳差異最小。ISSR 為物種鑒定提供了有力的工具。

1.3 第三代分子標記技術

1.3.1 SNP 標記技術

SNP 是最新型的遺傳標記技術，由單個核苷酸變化（包括替換、顛換、缺失和插入）引起的DNA 序列多態性，是遺傳變異中最常見的一種[2,13]；在基因組中的分布廣泛，在調控蛋白質功能、基因定位、生物性狀的關聯分析、群體遺傳系統發育分析與個體鑒定等領域應用前景極為廣泛。

Zhang 等[18]在7 種鮭科魚類（哲羅鮭、櫻鮭Oncorhynchus masou、美洲紅點鮭Salvelinus fontinalis、細鱗鮭Brachymystax lenok、白點鮭Salvelinus pluvius Hilgendorf、銀鮭silver salmon、虹鱒）檢測出虹鱒的SNP 多態性最高；Xu 等[19]在鯉（Cyprinus carpio）基因組中成功開發250K SNPs 用于基因分型，對鯉及相關物種的遺傳和種群研究具有深遠的意義。

1.3.2 EST 標記技術

EST 是作為遺傳標記應用與連鎖分析而發展起來的一項新的標記方法，最初應用于人類基因組的研究，進而應用于植物、動物等基因組的研究[2,13]。ESTs 對特定組織、特定時期表達的基因進行初步觀察。EST 常與其他標記技術結合用于水產養殖，有利于水產養殖物種的基因定位[9]。

藍身大斑石斑魚（Epinephelus tukula）是新興的經濟養殖魚類，生長速度快，Hsu 等[20]建立了基于轉錄組信息的EST 和SSR、SNP 結合技術，得到了與生長相關的多態性位點，可用于藍身大斑石斑魚MAS 和基因多樣性研究；RADONI? 等[21]開發了一套EST-SSR 標記監測藍鰭金槍魚養殖周期中的基因，對現有的EST-SSRs 資源進行補充，為石斑魚養殖中基因水平上的研究提供了技術支持。

2 分子標記在魚類生長相關性狀中的研究進展

生物生長是復雜的數量性狀和重要的經濟目標，受多個基因共同調控[22]，其基因在染色體上的位置稱為數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）。利用分子標記等遺傳學方法對生長性狀相關基因進行連鎖定位分析[23,24]，進而對QTLs 進行定位和遺傳分析是選擇性育種的基礎。

2.1 魚類生長相關基因

魚類生長相關基因包括主基因和候選基因，主基因與表型性狀高度相關，但生理功能不確定；候選基因是生理功能確定并直接影響生長性狀的表達，在染色體上與主基因相連，可作為QTL 的標記，深入研究候選基因有助于在水產養殖育種中獲得優良性狀[25]。

對SNPs 和生長有關的候選基因進行關聯分析是最早應用的技術，研究發現生長軸上的和生長調節因子家族中的基因是調節魚類生長最重要的基因。生長軸上的基因控制生長激素釋放激素（GH RH）、生長激素抑制激素（GHH 或生長抑素）、生長激素（GH）、胰島素樣生長因子（IGF-I 和IGF-II）等激素的合成，在調節生理代謝過程中不可或缺。除此之外，生長軸上還含有調控GH 和IGF 合成的胰島素（insulin）、甲狀腺激素（thyroid hormones）、糖皮質激素（thyroid hormones）基因等[22,25]。GH 參與細胞增殖、骨骼生長以及蛋白質合成過程，與組織細胞中的GRH 結合，刺激細胞產生IGF 并進入相應的受體細胞，通過調節糖代謝而調控細胞和機體的生長[22,25]。

對多種魚類的GH 等生長相關基因的SNP 分析發現，在外顯子、內含子、3’調控區、5’調控區上均含有與生長性狀顯著相關的SNPs 位點[25]，且草魚（Ctenopharyngodon idella）和鯉的GH 序列高度同源，虹鱒和大西洋鮭（Salmo salar）的GH 序列同源，而草魚和鮭鱒僅在少數外顯子中觀察到同源性[26]。除對少數已知生長相關基因進行SNPs 篩選外，還有大量生長相關候選基因有待研究。通過對硬骨魚類全基因組進行關聯分析，陸續在鯽（Carassius auratus auratus）[27]、斑點叉尾（Ictalurus Punetaus）[28]等魚類中發現了新的與體質量、體長等相關的SNP 位點。新的分子標記的成功篩選與定位對水產養殖分子輔助育種的發展具有重要意義。

2.2 分子標記輔助育種在魚類生長中的篩選與鑒定

選擇育種將生物表型作為育種目標，選擇性狀優良的個體雜交并在多代內定向選擇，提高優勢基因頻率，獲得符合人們預期的基因型或表型，使優良性狀穩定遺傳，最終獲得新品系（品種）。近年來基因組學、分子生物學和現代遺傳學快速發展帶動了遺傳連鎖圖譜構建、QTL 定位和分子標記輔助育種技術的進步。

傳統的育種方法對數量性狀的選擇效果并不明顯，標記輔助育種（Marker assisted selection，MAS）利用與性狀相關基因連鎖的分子標記選擇復雜的數量基因座，是對數量性狀候選基因進行選擇的有效方法[29]。

2.2.1 表型性狀

魚類生長速度是評價養殖產品質量的重要指標，也是選育的重要性狀之一，生長速度決定了養殖的生產速率和周期[29]，直接影響養殖業的經濟效益，提高養殖魚的生長速度是增加水產養殖業經濟效益的關鍵。

從19 世紀90 年代開始進行鯉生長性狀相關的分子標記篩選，至今已鑒定的QTL 達上千個。中國水產科學研究院黑龍江水產研究所梁利群課題組一直致力于鯉的研究，對大頭鯉和荷包紅鯉抗寒品系雜交F2代進行遺傳連鎖分析，鑒定出7 個與體長性狀顯著相關的SSR 多態性位點[30]；隨后利用265 個AFLP 標記、127 個SSR 標記、37 個EST-SSR標記和16 個RAPD 標記成功構建鯉遺傳連鎖圖譜[31,32]，并定位到6 個與體質量、體長、體高顯著相關，8 個與體長、體高、體厚相關的QTL 位點[33,34]。

除鯉之外，大西洋鮭也是較早進行遺傳研究的經濟價值較高的魚類[35]。DP Reid 等[36]定位到了8個與體質量相關的SSR 位點；隨后，Gutierrez 等[37]對5 個品種的大西洋鮭親本進行SSR 基因分型后，利用6.5 K SNP 標記技術篩選出6 個基因連鎖群上與體質量相關的主基因和候選基因QTL 區間。

在草魚MyoD 基因[38]中檢測出4 個多態性高、分型穩定的突變位點，利用SNP 和Indel 標記分型得到2 個分別與體長、全長、尾柄長、尾柄高和體質量、體寬、體高、眼間距顯著相關的突變位點，GHRH基因[39]上篩選得到4 個與生長存在顯著相關性的SNPs 位點，在載脂蛋白A-I-1（apoA-I-1）基因的非編碼區篩選得到2 個與體質量、體長、體高、頭長高度關聯的SNPs 位點，為草魚分子輔助育種提供了候選標記，為加快草魚育種進程奠定了基礎。

牛余澤等[37]用221 個SSR 標記構建牙鲆的遺傳連鎖圖譜并對數量性狀QTL 定位，得到4 個與生長顯著相關的SSR 位點；SUN 等[40]首次構建黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda）高密度遺傳圖譜，包含5 901 個SNPs 位點；Ali 等[41]在虹鱒體內鑒定出247 個與體質量增加相關的SNPs 位點，在編碼血栓反應蛋白-1（THBS1）基因中突變位點多態性最高。

2.2.2 肌肉品質

肌肉生長主要受到肌肉組織產生的肌源性調節因子（MRFs）和肌肉生長抑制素因子（MSTN）的調節。MRFs家族包括myogenin、MyoD、myf-5 和myf-6，僅在脊椎動物的骨骼肌中表達，參與肌肉生成；MSTN 屬于轉化生長因子β（TGF-β）家族，對肌肉的生長發育進行負調控[25]；魚類肌肉中還含有豐富的小清蛋白基因（PVALB1 和PVALB2），編碼的小清蛋白能夠調節肌肉纖維松弛度。SNPs 結果顯示：PVALB1 基因與幼魚體質量和體長性狀密切相關[42]；生長軸上GH 與GHR 結合能夠促進肌肉生長，IGF 及其受體對肌肉生長也起到調節作用。

Derayat 等[43]利用AFLP 和SSR 標記在大西洋鮭中篩選出一個與脂肪含量密切相關的QTL 位點；Baranski 等[44]在128 個與肉色相關的SSR 位點進行基因分型，得到32 個與肉質相關的多態性位點，為大西洋鮭魚肉質和生長候選基因的研究和遺傳育種提供了有力證據；毛瑞鑫等[45]在編碼乳酸脫氫酶（LDH）基因中定位到12 個SSR 位點；徐磊等[46]在大口黑鱸（Micropterus salmoides）新品種的選育過程中發現，IGF-I 基因上SNP 位點的生長優勢基因型隨選育代數累加。

2.2.3 抗逆性

抗逆性直接影響養殖魚的存活率和經濟效益。為提高養殖魚的產量和經濟價值，疾病、水資源環境對魚類生長提出了極大的挑戰，目前已在虹鱒、草魚、鯉等經濟魚類中廣泛開展了抗逆性研究。

低氧是水產養殖動物面臨的主要脅迫之一，嚴重影響魚類生長。利用cDNA-AFLP 確定鳙低氧反應中相關差異基因，揭示了鳙在低氧逆境中的生理和遺傳調控機制[47]。團頭魴（Megalobrama amblycephala）對水體溶氧的變化極為敏感，低氧耐受能力顯著影響表型性狀。基于高通量測序開發低氧相關SNP 標記[48]，Egln2 基因上的2 個完全連鎖的多態SNP 位點與耐低氧性狀密切相關，可作為團頭魴耐低氧新品系的分子特征標記[49]；

Perry 等[50,51]對虹鱒耐高溫性狀進行了SSR 研究，發現Ssa20.19NUIG 耐熱顯著關聯；抗傳染性造血壞死（infection hematopoietic necrosis，IHN）是虹鱒的高傳染性疾病，嚴重影響虹鱒各個生長時期的健康。Rodriguez 等[52]對虹鱒的回交品系DNA 提取物進行AFLP-RCR 后用SSR 標記進行IHN 定位，結果顯示：6 個AFLP 和6 個SSR 標記位于雌性遺傳圖譜的6 個連鎖群，16 個AFLP 和6 個SSR 定位于雄性遺傳圖譜的3 個連鎖群，IHN 的定位對虹鱒抗病育種具有重要參考價值；除虹鱒外，孫俊龍[53]在草魚LEAP-2 基因上發現2 個與抗病性顯著相關的SNP 位點（Site01 和Site02）。

3 展望

水產生物研究的最終目的是定位經濟性狀的基因座以用于培育優質新品種，提高水產養殖業的經濟效益和生態效益[54]。水產品為人們生活貢獻了15%以上的動物蛋白[55]，以人類基因組研究為基礎，已完成對多種模式生物的基因組研究。早期利用一代圖譜就已經對多種生物的QTL 進行了眾多研究，利用分子標記技術建立物理圖譜、高密度遺傳圖譜、性狀連鎖分析等。隨生物學發展二代測序技術的應用逐漸廣泛，與一代測序技術相比，二代測序技術不僅節省了測序成本，還保證了準確率，提高了測序效率，極大地推動了基因組學的發展[56]。

水產養殖產品的生長性能和品質性狀是復雜的數量性狀，基因與性狀的關系及其復雜，利用多種組學方式研究探索性狀是近代生物發展的主要趨勢。將分子標記技術和新一代測序技術、基因組學結合，利用分子標記技術對QTL 區間進行定位，篩選并鑒定目標性狀，選育出生長狀況良好、抗逆性強的新品種并穩定遺傳。數量性狀同時受主基因和候選基因的調控，但主基因和候選基因在不同的群中遺傳效應不同，一些QTL 與主基因連鎖并不緊密，現如今對候選基因的研究并不徹底，在基因組中QTL 的定位并不準確，遺傳距離較大，在今后實驗中還需要加大對QTL 精準定位的研究，準確定位目的基因位點從而篩選關鍵基因；另外利用多種組學結合方式研究已廣泛運用于人以及多種模式生物，但在水產生物上的研究應用還比較少，將分子標記技術與多組學研究結合加快水產生物的育種進程是未來的研究趨勢[54]。