煙草鐮刀菌根腐病拮抗細菌的篩選鑒定及促生防病效果

邱 睿，李小杰，李成軍，邢國珍，房文祎，李彩虹，張盈盈，姚晨虓，徐 敏，李芳芳，宋瑞芳，鄭文明，李淑君*，申 欣，張東鋒

煙草鐮刀菌根腐病拮抗細菌的篩選鑒定及促生防病效果

邱 睿1，李小杰1，李成軍1，邢國珍2，房文祎1，李彩虹1，張盈盈1，姚晨虓1，徐 敏3，李芳芳3，宋瑞芳3，鄭文明2，李淑君1*，申 欣4，張東鋒5

（1.煙草行業黃淮煙區煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，河南省農業科學院煙草研究所，河南 許昌 461000；2.河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002；3.中國煙草總公司河南省公司，鄭州 450018；4.河南省煙草公司洛陽市公司嵩縣分公司，河南 嵩縣 471400；5.河南省煙草公司許昌市公司建安分公司，河南 許昌 461000）

為挖掘對煙草鐮刀菌根腐病具有較強拮抗作用的生防菌株，采用稀釋涂布平板法從健康煙株根際土壤中分離純化對煙草鐮刀菌根腐病（root rot）主要病原具有一定拮抗作用的細菌，進行形態學、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定，并測定促生防病效果。經平板對峙測定，篩選出2株對煙草鐮刀菌根腐病病原具有較好抑制作用的菌株YX53和YX72，對茄病鐮刀菌（）的抑制效率分別為83.66%和73.54%，對尖孢鐮刀菌（）的抑制效率分別為57.57%和55.89%；2菌株無菌發酵濾液對病原孢子萌發抑制率為84.82%～100%，其揮發性化合物可抑制病原菌絲生長或產孢，且對煙草疫霉菌（）、根串珠霉菌（）等也有抑制效果。鑒定結果表明，YZ53和YX72分別為蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。經2菌株處理的煙苗胚根增長率分別達到了67.86%和161.61%，盆栽煙苗根長、最大葉面積、鮮質量等均有所增加；YX53盆栽防病效果在89.47%以上，YX72在99.53%以上。

煙草；鐮刀菌根腐病；芽孢桿菌；促生作用；抑菌效果

我國是煙草種植面積最大的國家[1]，病害一直是影響我國煙草生產的重要因素之一[2]。近年來隨著氣候條件、土壤微生態和耕作制度等的變化，煙草鐮刀菌根腐病已成為危害煙草生產的主要根莖類真菌病害[3-5]。引起煙草鐮刀菌根腐病的主要病原菌是尖孢鐮刀菌（）和茄病鐮刀菌（）[6]。目前防治作物鐮刀菌根腐病的主要策略是選用抗病品種和化學防治，但抗病種質資源有限、選育周期長，而化學防治則會造成環境污染、農藥殘留、病原菌產生抗藥性等問題[7]，且長期大量使用化學農藥還可加速病菌群體遺傳結構生理分化和變異[8]。近年來生物防治已成為防治植物病蟲害的重要手段[9]。何明川等[10]分離到的枯草芽孢桿菌（）MC4-2對煙草黑脛病的盆栽防效達到63.86%。翟穎妍等[11]報道了芽孢桿菌ZYY-4對煙草炭疽病具有高生物活性。許樂等[12]獲得的內生多粘類芽孢桿菌（）DS-R5通過抑制腐皮鐮刀菌孢子萌發，破壞菌絲結構和內部細胞器抑制病原菌生長，對丹參根腐病的盆栽防效可達到61.4%。目前鮮見關于煙草鐮刀菌根腐病生防細菌的系統篩選及其作用機制的相關研究。因此，本研究通過對健康煙株根際土壤微生物的分離、篩選，獲得對煙草鐮刀菌根腐病主要病原具有較好抑制作用的拮抗細菌菌株，明確其種類，測定其防效及對煙草的促生效果，為開發煙草鐮刀菌根腐病高效生防制劑提供資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年5月至2022年4月在煙草行業黃淮煙區煙草病蟲害綠色防控重點實驗室進行。供試土樣分別采自河南許昌襄城縣（褐土）、三門峽盧氏縣（黃棕壤）和澠池縣（紅粘土）。供試煙草品種中煙100。煙草鐮刀菌根腐病病原菌尖孢鐮刀菌B-9-1（）、茄病鐮刀菌A-4-9（）、煙草黑脛病病原菌寄生疫霉煙草致病變種（煙草疫霉）、煙草根黑腐病病原菌煙草根串珠霉（）、煙草白絹病菌（）、煙草立枯病病原菌立枯絲核菌（）、鳶尾絲囊霉菌（）及煙草潰瘍病病原菌葡萄座腔球菌（）均由河南省農業科學院煙草研究所提供。土壤細菌分離純化采用1/2 LB固體培養基，拮抗細菌發酵使用LB液體培養基，煙草病原真菌培養用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗細菌分離篩選 分別于2021年5—8月從豫中和豫西煙田病株周邊健株根際采集根際土樣40份。采用稀釋涂布平板法分離純化菌株[14]，參照宋光桃等[15]的平板對峙法進行拮抗菌篩選，根據抑菌帶寬度確定拮抗程度，選取拮抗效果好的菌株進行復篩。測量菌落半徑，計算抑菌率。

1.2.2 拮抗菌株無菌發酵濾液的抑菌活性測定 拮抗菌株無菌發酵濾液的制備：將對煙草尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌平均抑菌率大于50%的菌株活化后，參照千慧敏等[16]的方法制備菌液原液。將上述菌液原液12000 r/min離心10 min，上清液用細菌過濾器（0.22 μm）過濾2次后得到無菌發酵濾液。

拮抗菌株無菌發酵濾液對病原菌菌絲生長的影響：用打孔器在直徑9 mm的培養皿距離中央2.5 cm處均勻打3個孔，每孔注入200 μL的發酵濾液，以無菌的LB液體培養基為對照，待發酵液被培養基吸收完全后，在培養基中心接直徑5 mm的病原菌菌塊，每個處理重復3次。28 ℃黑暗培養7 d后，測量對照組和處理組病原菌菌落半徑，計算相對抑菌率。

拮抗菌株無菌發酵濾液對病原菌孢子萌發的影響：采用無菌發酵濾液與分生孢子共培養法[17]測定拮抗菌株對鐮刀菌分生孢子的影響，以無菌LB液體培養基處理為對照，每個處理重復3次，統計對照和處理組病原孢子萌發情況，計算孢子萌發率。

1.2.3 拮抗菌株揮發性化合物的抑菌活性測定 參照江木蘭等[18]的方法測定拮抗菌株揮發性化合物對煙草鐮刀菌根腐病病原的抑制作用。以空白的LB平板為對照，每個處理重復3次。28 ℃黑暗培養7 d，測定對照組和處理組病原菌菌落直徑，計算相對抑菌率，并在顯微鏡下觀察各處理產孢情況。

1.2.4 拮抗菌株抑菌譜的測定 采用平板對峙培養法[15]（略有改動，平行劃線改為對稱點接種），進行拮抗菌株對8種煙草病原真菌抑菌試驗，每個處理3次重復。

1.2.5 拮抗菌株的鑒定 參照董秀珠等[19]的《常見細菌系統鑒定手冊》進行形態學鑒定，利用芽孢桿菌鑒定試劑盒HIBacillusTM Identification Kit進行生理生化鑒定。參考千慧敏等[17]方法進行分子生物學鑒定，應用NCBI進行序列比對分析，采用MEGA 7.0軟件的Maximum likelihood法構建系統發育樹。

1.2.6 拮抗菌株對煙草種子萌發及促生作用測定 參照姚晨虓等[20]的培養皿濾紙保濕法進行測定，以無菌水處理的消毒種子為對照，每皿25粒種子（5×5），重復3次，第10天統計種子萌發率及測量種子胚根長度，計算增長率。

增長率=（處理組根系長度-對照組根系長度）/對照組根系長度×100%

尾水渠開挖總的施工程序是自上而下施工，先覆蓋層，后石方無用料開挖，再進行石方有用料(用于堆石壩填筑)分層開挖。半河床半河岸段，逆水流方向分段開挖。分段長度約200m。各級開挖邊坡形成之前完成相應高程的地表及生態放流的引排水施工。

1.2.7 拮抗菌株盆栽促生試驗 將1.2.2中離心得到的沉淀用無菌水重懸，將活菌濃度調至6×108CFU/mL。參考千慧敏等[16]的方法進行盆栽促生試驗。20 d后，根據中華人民共和國煙草行業標準（YC/T 142—2010）[21]中的農藝性狀測量方法，測定拮抗菌株對煙草農藝性狀的影響，測量指標包括有效葉片數、最大葉長、最大葉寬、地上鮮質量和根系鮮質量，葉面積（cm2）=0.6345×葉長（cm）×葉寬（cm）。

1.2.8 拮抗菌株盆栽防病試驗 取長勢一致的3～4片真葉煙苗移栽至裝有無菌基質的滅菌花盆（85 mm×70 mm）中培養2 d后，進行拮抗菌懸浮液（6×108CFU/mL）灌根，每株20 mL，灌根結束后48 h，在煙根周圍分別接種預先培養好的帶有靶標菌（尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌）的麥粒，5 g/株，接靶標菌后72 h，再次進行拮抗菌懸浮液灌根，每株20 mL，以不做任何處理的煙株為陰性對照（CK1），只接病原菌為陽性對照（CK2），每處理15株。所有處理置于28 ℃、光暗周期16 h/8 h、相對濕度70%條件下培養。培養第20天參照國家標準（GB/T 23222—2008）[22]煙草病害分級及調查方法進行發病情況調查，計算病情指數及拮抗菌防效。

病情指數=Σ（病級數×該病級植株數）/（最大病級數×植株總數）×100

防治效果=（對照組病情指數-處理組病情指數）/對照組病情指數×100%

1.3 數據統計與分析

數據處理采用Excel和DPS 7.05軟件分析，方差分析采用Duncan新復極差法。

2 結 果

2.1 拮抗菌株的分離篩選

經稀釋涂布平板法，從40份土壤樣品分離純化得到42株細菌。以煙草鐮刀菌根腐病主要病菌為靶標，經平板對峙法進行初篩和復篩，篩選出5株對病原菌有拮抗效果的菌株。從表1看出，YX53和YX72對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的抑菌率顯著高于CK及其他菌株，達到55.89%～83.66%。

表1 拮抗菌株對煙草尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的抑菌效果

注：表中數據為3次重復的平均值±；同列數據后的不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）；下同。

Note: the data in the table were means±. The different lowercase letters in the table represents 5% significant difference level (<0.05). The same below.

2.2 拮抗菌無菌發酵濾液的抑菌活性測定

由圖1看出，YX72的發酵濾液對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的菌絲生長具有抑制作用。2株拮抗菌株發酵濾液均能抑制病原菌孢子萌發，LB液體培養基處理病原菌孢子萌發率達到45%以上，拮抗菌發酵濾液處理孢子萌發率僅有0%～7.21%，其中YX72發酵濾液可完全抑制茄病鐮刀株菌孢子萌發（表2）。

圖1 拮抗菌無菌發酵液的抑菌活性

表2 拮抗菌無菌發酵液對病原菌孢子萌發的影響

2.3 拮抗菌揮發性化合物的抑菌活性測定

由表3看出，2株拮抗菌株揮發性有機化合物（VOCs）對茄病鐮刀菌菌絲生長的抑菌率約為26%。2株拮抗菌VOCs影響病原產孢，YX53和YZ72揮發性化合物處理過的和產孢量顯著低于對照，對病原產孢抑制率達93.95%～100%（圖2）。

2.4 拮抗菌株對煙草病原的抑菌譜測定

表4表明，2株拮抗菌對供試的8種煙草根莖類真菌病害病原菌均有不同程度的抑制作用。2菌株對茄病鐮刀菌的平均抑菌率均大于70%，對尖孢鐮刀菌和煙草疫霉菌的抑菌率均大于50%，菌株YX72對煙草根串珠霉和鳶尾絲囊霉菌的抑菌率約55%，對煙草白絹病菌、立枯絲核菌和葡萄座腔球菌的抑菌率為42.06%～47.64%；菌株YX53對煙草根串珠霉等5種病原菌的抑菌率低于YX72，抑菌率為23.81%～43.30%。

2.5 拮抗細菌的鑒定

2.5.1 形態學及生理生化鑒定 圖3顯示，菌株YX53為革蘭氏染色陽性，在LB培養基上28 ℃黑暗培養48 h，菌落近圓形，無色素，圓心白色微凸，邊緣乳白色，顯微觀察菌體細胞桿狀，末端鈍圓，成短或長鏈，（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，符合蠟樣芽孢桿菌特征；菌株YX72革蘭氏染色陽性，在LB培養基上28 ℃黑暗培養48 h，菌落表面粗糙不透明，白色，顯微觀察菌體細胞長桿狀，單個或鏈狀排列，單個細胞（0.7～0.8）μm × （2.0～3.0）μm，符合枯草芽孢桿菌特征。表5結果表明，YX53和YX72生理生化特性分別與蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌一致。

表3 拮抗菌株VOCs對病原菌的抑制效果

圖2 拮抗菌揮發性化合物對病原菌產孢的影響

表4 兩株拮抗菌株對8種病原菌抑菌效果

Table 4 Inhibitory effects of the 2 strains on the 8 plant pathogens

菌株Strains指標Index尖孢鐮刀菌F. oxysporum茄病鐮刀菌F. solani煙草疫霉P. nicotianae煙草根串珠霉T. basicola煙草白絹病菌S. rolfsiii Sacc立枯絲核菌R. solani鳶尾絲囊霉菌A. iridis葡萄座腔球菌B.dothide YX53菌落半徑/cm 1.73±0.12b0.80±0.06c1.93±0.03b2.40±0.06b3.30±0.06b3.20±0.06b3.03±0.03b2.53±0.03b 抑菌率/%60.17±3.48a80.96±1.25a54.50±1.07a43.30±1.44b23.85±0.88b23.81±1.37b29.45±0.48b40.62±0.68b YX72菌落半徑/cm1.87±0.09b1.13±0.09b1.90±0.06b1.97±0.03c2.33±0.12c2.43±0.03c1.90±0.06c2.23±0.12c 抑菌率/%57.30±1.17b72.97±2.39b55.31±1.06a53.54±0.69a46.18±2.51a42.06±0.79a55.82±1.17a47.64±2.94a CK菌落半徑/cm4.37±0.09a4.20±0.06a4.25±0.03a4.23±0.03a4.33±0.03a4.20±0.00a4.30±0.06a4.27±0.03a 抑菌率/%————————

注：A和B為YX53和YX72菌落形態，A’和B’為對應菌體細胞結構。

Note: A and B is the colony morphology of YX53 and YX72, A’ and B’is the cell structure of corresponding bacteria.

圖3 拮抗菌株形態特征

Fig. 3 Morphological characteristics of the 2 strains

表5 芽孢桿菌鑒定試劑盒檢測結果

注：“+”表示陽性，“?”表示陰性，“D”表示延遲。Note: “+” means positive, “?“ means negative, “D” stand for delay.

2.5.2 分子生物學鑒定 將PCR獲得的待測菌株16S rDNA序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析，結果顯示，菌株YX53（ON497154）與蠟樣芽孢桿菌（）EH11（MN750766.1）等的序列相似性達到100%，YX72（ON497155）與枯草芽孢桿菌（）MK736112.1（MT111083.1）等的序列相似性達到100%。從圖4看出，YX53和YX72分別與蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌聚于同一分支。結合形態學和生理生化鑒定，鑒定YX53和YX72分別為芽孢桿菌屬的蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。

圖4 基于16S rDNA構建的系統發育樹

2.6 拮抗菌株對煙草種子萌發及促生作用測定

從圖5可知，菌株YX72處理的煙草種子萌發率與對照基本一致，YX53處理種子萌發率低于CK，3個處理間無顯著差異（＜0.05）。表6表明，拮抗菌處理的煙苗胚根較CK均有不同程度增長，以YX53處理組胚根發育最好，煙苗胚根增長率達到161.61%，YX72處理組煙苗胚根增長率達到了67.86%。

圖5 拮抗菌對種子萌發率的影響

表6 拮抗菌對煙草根系發育的影響

2.7 拮抗菌株對盆栽煙草的促生作用

從表7可知，YX53處理盆栽煙株最大葉面積、地上鮮質量、根系鮮質量、總根長和總根表面積較對照分別提高了32.55%、46.61%、67.11%、168.20%和94.55%，YX72處理煙株最大葉面積、地上鮮質量、根系鮮質量、總根長和總根表面積較CK分別提高了73.88%、103.58%、153.69%、231.89%和109.09%，對煙株促進作用較YX53強。

2.8 拮抗菌對盆栽煙草鐮刀菌根腐病的防病效果

由表8看出，CK1處理煙株不發病，只接種病原菌的處理CK2煙株發病率為100%，病情指數達到53以上。與CK2相比，YX53和YX72發酵液處理煙株的發病率在0.00%～23.34%，YYX53對煙草尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌根腐病的平均防效分別為89.47%和99.35%，略低于YX72的99.53%和100%，說明菌株YX53和YX72對煙草鐮刀菌根腐病具有顯著的防治效果。

表7 拮抗菌對盆栽煙草的促生效果

表8 拮抗菌株對煙草鐮刀菌根腐病的防治效果

3 討 論

生防菌廣泛應用于農業生產病害防治[23]，目前關于煙草鐮刀菌根腐病生防資源篩選利用的研究報道較少，譙天敏等[24]研究表明蠟樣芽孢桿菌（）Y6對尖孢鐮刀菌（）的抑菌率為30.6%；李姝江等[25]篩選的蠟樣芽孢桿菌B3對茄病鐮刀菌（）具有較強的拮抗作用，抑菌帶達26.0 mm，盆栽防效為25.57%～97.56%；倪方方等[26]研究表明枯草芽孢桿菌（）對白術尖孢鐮刀菌的平板對峙抑菌率為52.3%，盆栽防效36.33%；姚鳳琴等[27]報道了枯草芽孢桿菌Bv17對茄病鐮刀菌的平板抑菌率為85.44%，盆栽防效70.52%～97.32%。本研究篩選的蠟樣芽孢桿菌YX53和枯草芽孢桿菌YX72，對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的平板抑菌率為55.89%～ 83.66%，盆栽防效達到89.47%～100%，優于已報道的其他蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，這可能是因為本研究從煙株根際土壤中篩選出的拮抗菌株對煙田土壤環境和煙株具有更強的適應性[28]，能更好地在煙草根際定殖并發揮作用。

芽孢桿菌可通過形成抑菌物質、合成促生長激素促進植物生長發育、誘導系統抗性等，提高植物抗病能力[23,29]。ZHAO等[30]研究表明枯草芽孢桿菌CF-3的揮發性化合物和發酵濾液對膠孢炭疽菌孢子萌發的抑制率分別為70.11%和57.36%；黃秋斌等[31]報道的蠟樣芽孢桿菌0-9對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑菌率為50%，其代謝物對尖孢鐮刀菌分生孢子萌發的抑制率為61.2%。衛甜等[32]研究表明，枯草芽孢桿菌BT-6和蠟樣芽孢桿菌JJN2可提高水稻種子苗長和促進幼苗生長，苗長和鮮質量增長率最大達到20.79%；鐘澤翔[33]篩選的13株枯草芽孢桿菌處理下，黃瓜種子胚根根長和幼苗鮮質量增幅分別達3.62%～55.32%和5.66%～27.45%。本研究表明，菌株YX53和YX72的無菌發酵濾液對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌孢子萌發抑制率為84.82%～100%，其揮發性化合物對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌產孢抑制率達93.95%～100%；YX53和YX72處理煙苗胚根根長和煙株鮮質量分別增加了67.86%～161.61%和46.61%～153.69%，其抑菌促生作用顯著優于已報道的其他枯草和蠟樣芽孢桿菌。菌株YX53、YX72對煙草疫霉、根串珠霉等6種煙草真菌病原菌也有較好的抑菌作用，表明枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌抑菌譜廣，與前人研究一致[31-32]。

4 結 論

本研究篩選鑒定出對煙草鐮刀菌根腐病具有較好防治作用的蠟樣芽孢桿菌YX53（）和枯草芽孢桿菌YX72（），盆栽防效達到89.47%以上。2株芽孢桿菌可通過抑制病原菌絲生長、病原孢子萌發和病原產孢等抑制病原菌生長發育，同時可促進煙株生長發育，提高煙株抗病性，為煙草鐮刀菌的生物防治提供了新的菌種資源。

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Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against TobaccoRoot Rot and Evaluation of Their Effects on Growth Promoting and Disease Control

QIU Rui1, LI Xiaojie1, LI Chengjun1, XING Guozhen2, FANG Wenyi1, LI Caihong1, ZHANG Yingying1, YAO Chenxiao1, XU Min3, LI Fangfang3, SONG Ruifang3, ZHENG Wenming2, LI Shujun1*, SHEN Xin4, ZHANG Dongfeng5

(1. Key Laboratory for Green Preservation & Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area, Tobacco Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Xuchang, Henan 461000, China; 2. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 3. Henan Provincial Tobacco Company, Zhengzhou 450018, China; 4. Songxian Branch, Luoyang Company of Henan Tobacco Company, Songxian, Henan 471400, China; 5. Jian’an Branch, Xuchang Company of Henan Tobacco Company, Xuchang, Henan 461000)

In order to screen for strains that have good antagonistic effects on tobaccoroot rot, bacteria that have good antagonistic effects were isolated and purified from the rhizosphere of healthy tobacco by the dilute coating plate method. Antagonistic bacteria were identified by morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis, and the growth promotion and disease control effects were determined. Two bacterial strains YX53 and YX 72 that have good antagonistic functions were selected. The plate inhibitory test showed that the inhibition efficiency of YX53 and YX72 were 83.66% and 73.54% against, 57.57% and 55.89% against, respectively. The inhibition rate of YX53 and YX72 fermentation broth on pathogenic spore germination was 84.82%-100%, and the volatile organic compounds of the two antagonistic strains could inhibit the growth of pathogenic filaments or sporulation, also they had inhibitory effects on tobacco root disease pathogens such as,, etc. YX53 and YX72 were identified asand, respectively. The two strains had significant growth promotion and disease inhibition effects. The radicle growth rate of the tobacco seeds treated with YX53 and YX72 reached 67.86% and 161.61%, respectively. And the root length, the maximum leaf area and fresh weight etc. of the treated seedlings were all increased. The disease prevention effects of YX53 and YX72 were more than 89.47% and 99.53% respectively.

tobacco;root rot;spp.; growth promotion; inhibitory effect

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.005

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0031-08

河南省煙草公司科技項目（2020410000270012）；河南省農業科學院優秀青年科技基金計劃項目（2022YQ09）；河南省農業科學院科技創新團隊（2022TD26）；河南省高等學校重點科研項目計劃（20B210009）

邱 睿（1984-），女，助理研究員，主要從事煙草鐮刀菌根腐病綠色防控相關工作。E-mail：qiurui19840414@hotmail.com

，E-mail：13603749396@126.com

2022-05-18

2022-09-22