自噬對激素性股骨頭壞死大鼠模型血脂及血液流變學的影響

劉樹義，蘭 凱，張旭東，李 瑜

（1.西安醫學院臨床醫學院外科學教研室，陜西 西安 710021；2.西安醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉科，陜西 西安 710038）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是非創傷性股骨頭壞死中最常見的類型，約占51%，其發病與激素過量或長期使用密切相關[1]。近年來，隨著激素的廣泛應用，其發病率呈逐年增加趨勢，且以男性青壯年居多。研究顯示[2]，口服潑尼松的劑量每日提高10 mg，股骨頭壞死的發病率就會提高4.6 倍。由于SANFH 通常累及雙側髖關節，致殘率較高，給患者家庭和國家造成巨大的經濟損失和社會負擔，已成為威脅社會及人類健康的難治性疾病。目前對SANFH 的治療僅局限于手術治療，近70%的患者通過實施人工髖關節置換術能有效改善患者的生活質量，總體療效顯著[3]；但由于人工關節材料有一定的使用壽命，且關節置換術后存在假體周圍骨折、感染、假體松動等并發癥，使手術治療存在著局限性[4]。因此，研究SANFH 的發病機制及尋找更加有效的非手術治療方法，是目前亟待解決的臨床問題。研究表明[5]，激素是誘導自噬的重要因素，自噬活性增強的結果是細胞發生過度死亡。SANFH 作為大劑量激素使用的并發癥之一，很可能與自噬存在密切關系。此外，部分研究結果顯示，正常情況下，機體可通過“噬脂”現象來調節肝臟和脂肪組織中甘油三酯的代謝，即自噬性調節途徑[6]，但在病理狀態下，這種自噬性調節的方向是不明確的，甚至會造成脂質代謝紊亂[7，8]。韓曉蕊等[9]利用多模態MRI 技術分析SANFH 患者股骨頭時發現，在壞死區脂肪含量明顯高于非壞死區。基于此，推測SANFH 的發病與自噬、脂質代謝紊亂有密切聯系，而導致股骨頭出現壞死的途徑很可能是：①自噬活性增強后，骨細胞出現過度自噬性死亡；②激素誘導自噬活性增強后，機體脂質代謝紊亂，造成股骨頭內脂肪堆積、高壓，繼而骨細胞發生缺血壞死。為證實上述假設，本研究通過構建SANFH 大鼠模型，并誘發體內細胞自噬活性，進一步分析自噬對SANFH 大鼠脂質代謝的作用，為尋找更加有效的治療途徑提供思路與理論依據，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 本研究實驗動物SD 大鼠24只（清潔級）購自西安交通大學醫學部實驗動物中心[動物合格證：SCXK（陜）2018-001]，雌、雄各半，平均體重為（286.12±12.96）g。脂多糖（貨號：L8880）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，貨號：IM0190）、雷帕霉素（Rapamycin，貨號：R8140）購自北京索萊寶科技有限公司；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/瓶）購自輝瑞制藥有限公司；RIPA 裂解緩沖液（碧云天，P0013C）。

1.2 方法

1.2.1 分組及動物模型制備 大鼠進入動物中心后，適應性飼養1 周，采用隨機數字表法分為4 組：對照組、模型組、自噬阻斷組及自噬激動組，每組6 只，并采用大鼠耳標進行標記。將脂多糖溶于二甲基亞砜（DMSO）溶液中，濃度為0.01 μg/μl；甲強龍溶于生理鹽水，濃度為40 mg/ml，分別將3-MA、雷帕霉素溶于DMSO 溶液，濃度均為1 mg/kg。模型組、自噬阻斷組及自噬激動組大鼠稱重后，按20 μg/kg 劑量先經腹腔注射脂多糖2 次，每次間隔24 h，對照組經腹腔給予20 μg/kg 生理鹽水。脂多糖注射結束后，間隔24 h，按40 mg/kg 劑量，經兩側臀肌交替給予模型組、自噬阻斷組及自噬激動組大鼠甲強龍注射，共3 次，每次間隔24 h；自噬阻斷組、自噬激動組每次肌肉注射甲強龍前30 min，分別經腹腔注射3-MA（2.5 mg/kg）、雷帕霉素（1 mg/kg），對照組大鼠經臀肌、腹腔注射1 ml/kg 生理鹽水。藥物注射完成后繼續飼養，并將大鼠將置于跑步機中，以1 km/h速度勻速跑動，30 min/次，2 次/周，跑動后正常籠中飼養，自由進食飲水。8 周后，經核磁共振（MRI）檢查確認大鼠模型復制成功。模型制作結束后，采用10%水合氯醛進行腹腔麻醉，將大鼠固定于手術臺上，常規消毒后用剪刀沿腹部中線打開腹腔，腹主動脈暴露清晰后保持入針角度約30°刺入采血針，連接真空采血管采集8～10 ml 血液，于4 ℃靜置2 h后以3000 r/min 離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。采血結束后，剪開雙側髖關節囊，剔除關節周圍肌肉組織，充分暴露股骨頭后，用刀片從冠狀面劈開兩半，其中一半置于10%中性甲醛溶液進行固定，另一半置于-80 ℃保存。

1.2.2 自噬活性評價方法 將上述股骨頭組織稱重后，加入液氮進行研磨，將骨質碎屑轉移至1.5 ml 離心管中，按每20 mg 組織加入250 ml RIPA 裂解緩沖液，提取組織蛋白。BCA 法蛋白定量后采用Western blot 檢測股骨頭內LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平。

1.2.3 血液流變學及血脂測定 經腹主動脈采血4 ml于抗凝管中，并在4 h 內采用全自動血液流變儀測定全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積及紅細胞聚集指數等。采2 ml 血于促凝管中，離心制備血清，采用自動生化儀三聯酶法檢測血清總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計數資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 股骨頭壞死情況分析 4 組SD 大鼠中，除對照組無股骨頭無壞死外，模型組、自噬阻斷組及自噬激動組股骨頭壞死率分別為率分別為83.33%（5/6）、16.67%（1/6）、100.00%（6/6），組間比較，差異有統計學意義（χ2=17.110，P＜0.05）。

2.2 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達情況 4 組大鼠股骨頭組織中，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白均有不同程度表達，其中自噬阻斷組低于對照組及模型組，自噬激動組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達高于對照組及模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 四組SD 大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較（）

表1 四組SD 大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較（）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；▲與自噬阻斷組比較，P＜0.05；▼與模型組比較，P＜0.05

圖1 4 組SD 大鼠股骨頭組織Western blot 檢測

2.3 各組血脂比較 應用激素后，模型組、自噬阻斷組及自噬激動組TG、TCH、HDL 較對照組均有不同程度升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而各組LDL比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠血脂情況比較（，mmol/L）

表2 各組大鼠血脂情況比較（，mmol/L）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；▲與自噬阻斷組比較，P＜0.05；▼與模型組比較，P＜0.05

2.4 各組血液流變學指標比較 模型組、自噬阻斷組及噬激動組全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數均高于對照組，差異有統計學意義（F=23.462，P＜0.05），見表3。

表3 四組大鼠血液流變學指標比較（）

表3 四組大鼠血液流變學指標比較（）

注：*與對照對照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；▲與自噬阻斷組比較，P＜0.05；▼與模型組比較，P＜0.05

3 討論

激素類藥物已廣泛應用于自身免疫性疾病、重癥感染、SARS 等疾病的治療，但隨著激素使用劑量的增加和時間的延長，易造成多種并發癥的出現，SANFH 是其中致殘率較高的一種。目前對于SANFH 的發病機制尚不明確。但隨著研究的深入，關于該病的發病機制形成了多種理論，包括血管內凝血[10]、骨髓間充質干細胞分化[11]、脂質代謝紊亂[12]、骨細胞凋亡[13]、骨質疏松[14]等理論。近年來越來越多的學者認為，細胞的死亡在一定程度上受到了基因的調控，即程序性細胞死亡，包括凋亡和自噬兩種形式。在生理條件下，自噬可通過加快細胞代謝循環、協助細胞適應環境達成促進細胞存活的效果，但當機體細胞受到多種體內、外因素（如激素、缺氧、饑餓等）的作用時，其活性增強后可過度吞噬細胞內細胞器和細胞質，從而誘導細胞死亡[15]。此外，自噬也是機體自身脂肪代謝和干細胞成脂分化的重要調節途徑，尤其是在肝細胞和脂肪細胞[16]。石少輝等[17]通過對63 例SANFH 患者的股骨頭進行形態學觀察發現，與創傷性股骨頭壞死患者相比，SANFH 股骨頭內脂肪面積、脂肪細胞密度、脂肪細胞直徑均增加，而骨髓內造血面積明顯減少，電鏡結果提示骨髓內充滿大小不等的脂滴。韓曉蕊等[18]應用MRIIDEALIQ 和IVIM-DWI 序列檢查30 例SANFH 患者時發現，股骨頭內脂肪分數和灌注分數均明顯高于正常人。Motomura G 等[19]對4 例有早期股骨頭壞死的尸體研究發現，早期激素性骨壞死患者脂肪細胞體積增大，而梁大偉等[20]對478 例股骨頭壞死患者進行病因調查分析時發現，SANFH 患者血脂水平明顯高于正常。由此可見，SANFH 的發病可能與脂質代謝紊亂有密切關系。然而，在SANFH 發病過程中，激素誘導自噬活性的增強是否對患者體內脂質代謝紊亂發揮了作用，仍有待進一步研究。

本研究通過構建SANFH 大鼠模型，并使用自噬調節劑進行干預，結果顯示，大劑量使用甲強龍后，大鼠出現明顯脂質代謝紊亂的現象，血液中TG、THC 及HDL 水平明顯升高；當同時給予大鼠甲強龍和自噬阻斷劑3-MA 時，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達明顯下降，脂質代謝紊亂有所緩解，血液中TG、THC 及HDL 水平較模型組大鼠呈大幅度下降趨勢，但仍高于對照組；當同時給予甲強龍和自噬激動劑雷帕霉素時，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達明顯升高，脂質代謝紊亂也更加嚴重，血液中TG、THC 及HDL 水平大幅升高，且明顯高于模型組和自噬阻斷劑組（P＜0.05），這些結果均提示在激素的誘導下，自噬對SANFH 大鼠血脂有顯著的調節作用，且自噬活性越高，血脂水平越高。此外，當對4 組大鼠血液進行流變學檢測時，發現應用甲強龍后，大鼠血液全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積及紅細胞聚集指數均出現明顯改變，且高于正常水平。當同時應用自噬阻斷劑3-MA 時，上述血液流變學指標均明顯降低，但仍高于正常；當同時應用自噬激動劑雷帕霉素時，上述血液流變學指標顯著升高（P＜0.05），這提示激素誘導下，自噬對血液流變學也具有調節作用，且自噬活性越強，血液粘度越大，高粘滯血癥也嚴重。在藥物干預結束后，所有大鼠經MRI 檢查，結果發現對照組、模型組、自噬阻斷劑組及自噬激動劑組大鼠股骨頭壞死率分別為0、83.33%、16.67%及100.00%，這與各組大鼠脂代謝紊亂嚴重程度及血液流變學改變情況具有高度一致性。導致這種現象的主要原因在于①激素誘導的自噬活性增強，能夠使體內血脂水平升高，進而使骨細胞出現脂肪變性、骨細胞核膜溶解；②激素誘導的自噬，同時也能使血液流變學發生顯著改變，血液粘滯度增加，股骨頭血液灌注量不足。微循環中血液通常是按照泊肅葉定律在流動，即毛細管中的流量與黏度成反比，當血液黏度升高時微循環灌注量將下降。此外，激素類藥物能改變紅細胞膜兩側的電化學梯度，使紅細胞變形能力下降，紅細胞之間的黏附力增加，最終會引起紅細胞聚集效應[21]，而這種效應很可能也是自噬活性增強后調節血液流變學的結果。目前，許多研究表明[22，23]，SANFH 的發病與脂質代謝紊亂、高粘滯血癥密切相關，通過調節血脂和改善血液動力學情況，能夠在一定程度上預防和降低本病的發生率[24]，而且本研究也發現抑制自噬后能夠大大降低股骨頭壞死的發生率。

綜上所述，在SANFH 大鼠中存在脂質代謝紊亂和高粘滯血癥的現象，而這些現象的發生與體內自噬活性增強有密切關系。激素誘導的自噬能夠使血液中血脂水平顯著高于正常，血液流變學指標同樣有明顯改變，而自噬被抑制后，能大幅改善血脂和血液流變學情況，股骨頭壞死率呈明顯下降。這充分說明自噬對SANFH 血脂、血液流變學的調節有重要意義，在未來有望成為治療SANFH 的重要途徑之一。此外，本研究的不足之處在于未開展機制方面的研究，尚未找到干預的精準靶點，在今后的研究中將著力于此。