紫花苜蓿UV-B光受體基因MsUVR8的克隆及功能研究

趙麗晶，劉 英，習亞君，王小飛，高麗美

(山西師范大學 生命科學學院, 太原 030000)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上種植面積和種植范圍最廣泛的豆科牧草[1]，也是一種藥用植物，具有抗菌、抗炎、抗哮喘、利尿和改善記憶等藥用功效[2]。研究表明，紫花苜蓿根系對各種環境污染物具有耐受性[3]，在改善和修復生態環境方面扮演重要角色。在中國紫花苜蓿有2000多年的種植歷史，現主要分布于華北、東北、西北等地區。然而，北方地區太陽紫外線輻射強度的不斷增加，對苜蓿種植和生產構成了潛在威脅[4]，因此，研究紫花苜蓿UV-B響應機制對于指導苜?？鼓嬗N具有重要意義[5]。

UV-B(280～320 nm)是太陽光固有的組成部分。大氣中約95% UV-B被臭氧層吸收，并以1 W/m2的平均強度到達地球表面[6]。UV-B輻射會對植物光敏形態建成產生明顯影響，進而改變植物的生長發育[7]。UV-B輻射具有雙重效應，一方面可以作為調控生長發育的信號因子，同時高劑量UV-B輻射也可以對植物器官發育造成抑制[8-9]。UV-B增強會誘發植物產生不同的生物學效應，如一定劑量的UV-B輻射可誘導植物葉片過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，激活葉片清除自由基的能力，提高植物對UV-B脅迫的抗性[10]。但是，高強度UV-B 輻射則會嚴重抑制植物生理代謝，降低作物的產量品質[11]。因此，高等植物通過增強自身免疫系統形成了多種重要的抗逆防御機制，如UV-B特異性光受體——UVR8 介導的光信號轉導途徑就是植物適應UV-B脅迫的重要策略之一[12]。

UVR8(UV resistance locus 8)是植物感知UV-B的光受體，也是目前唯一報道的紫外光受體[13]。UV-B輻射可誘導UVR8發生單體化激活和核內積累[14]，通過與一系列轉錄因子互作，參與調控植物的光形態發生[15]。在沒有UV-B的情況下，UVR8蛋白形成同源二聚體，分布于細胞質和細胞核中；而在暴露于UV-B輻照作用下時，UVR8利用其色氨酸作為發色團感知UV-B，發生單體化激活[16]，快速進入并積累到細胞核內[17]。UVR8進化上高度保守，在綠藻、苔蘚和被子植物光敏形態建成中都發揮著積極作用[18]。在擬南芥葉片中，UV-B輻射下類黃酮和花青素合成過程受到UVR8受體的調節[19]。他人研究表明，除了介導UV-B光信號轉導外，UVR8還參與調控著了其他多個生理發育過程。例如UVR8調節番茄果實葉綠體的發育，以及葉綠素、類胡蘿卜素、淀粉和番茄紅素的合成，從而影響其成熟發育和營養品質[20]。然而，目前關于UVR8的研究主要集中在蛋白結構、分子進化、光信號的吸收、傳遞等方面[21], 且對UVR8信號調控機制研究較清楚的僅限于模式生物擬南芥，關于豆科植物紫花苜蓿UVR8的研究報道還尚屬空白。

本研究采用RACE擴增技術分離克隆了紫花苜蓿的一個UV-B光受體基因MsUVR8，在詳細闡述其生物信息特性和系統進化關系的基礎上，采用紫花苜蓿細胞為受體材料進行遺傳轉化，篩選獲得了紫花苜蓿MsUVR8過表達系，并對其生物學功能進行了初步探究。這些結果將填補植物UV-B光受體研究領域的空白，也為深入了解豆科植物響應UV-B的分子機制奠定了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)‘金皇后’種子由江蘇草業有限公司提供。紫花苜蓿種子在(21±2)℃、相對濕度70%、光/暗周期16 h/8 h的培養室中培養2周。

大腸桿菌DH5α(EscherichiacoliDH5α)、農桿菌GV3101(AgrobacteriumGV3101)、真核表達載體pCAMBIA1300-GFP由本實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 紫花苜蓿MsUVR8基因克隆提取紫花苜蓿幼苗RNA并反轉錄合成cDNA。根據同源物種蒺藜苜蓿MtUVR8(XM_003630280.3)序列，設計特異性引物F(CTTCACCTCCCCATGTTCTTCTTAT)和R(TTGGAACAACCGCATATCTCTCTGA)，進行PCR反應后回收PCR產物進行測序。

1.2.2 RACE擴增及序列驗證根據UVR8核心片段的堿基序列，設計3′-RACE和5′-RACE擴增引物進行擴增。為進一步確定紫花苜蓿MsUVR8基因的全長序列，重新設計引物進行驗證。根據測序結果找到其CDS區，設計特異性引物進行PCR反應。

1.2.3 生物信息學分析進入NCBI數據庫對紫花苜蓿MsUVR8基因序列進行Blastn檢測，對紫花苜蓿MsUVR8蛋白進行Blastp檢測，分析序列相似性。進入ExPASy網站分析蛋白質的一級結構，進入HMM網站預測蛋白質的二級結構。用Phyre2網站預測蛋白質的三級結構。用MEGA軟件對紫花苜蓿UVR8蛋白的同源序列進行多序列比對構建UVR8蛋白系統進化樹。

1.2.4 黃酮醇熒光檢測及抗氧化性能檢測對野生型和MsUVR8過表達的愈傷組織，以及UV-B輻射處理的野生型和MsUVR8過表達的愈傷組織，進行對-二苯氨基苯基硼酸(DPBA)-黃酮醇熒光染色、二氨基聯苯胺(DAB)染色和氮藍四唑(NBT)染色，然后顯微鏡下觀察。

1.2.5 UV-B信號通路相關基因表達對紫花苜蓿野生型和MsUVR8過表達的愈傷組織、低劑量UV-B輻射處理后的野生型和MsUVR8過表達的愈傷組織，進行RNA提取并反轉錄成cDNA。設計苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)、黃酮醇合成酶(FLS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的特異性引物(表1)，以cDNA為模板，用試劑盒進行實時熒光定量PCR分析，檢測與類黃酮合成相關基因的相對表達量，使用2-ΔΔCt法進行計算。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 MsUVR8同源克隆

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，3′-RACE擴增獲得約750 bp條帶，5′-RACE擴增獲得約450 bp條帶，經拼接兩段序列獲得MsUVR8基因的全長序列為1 678 bp(圖1)。進一步分析其堿基序列中開放閱讀框區域，設計引物PCR擴增獲得長為834 bp的一段CDS序列(圖2)，命名為MsUVR8。

2.2 MsUVR8生物信息學分析

分析顯示，MsUVR8基因堿基序列和編碼氨基酸序列與蒺藜苜蓿的相似度均高達95%以上。MsUVR8蛋白形成了不完整的β-折疊結構，蒺藜苜蓿MtUVR81(>XP_003630328.2)具有7個β-折疊結構，MtUVR82(>XP_003630331.2)則也形成了不完整的折疊結構。另外，羅秋蘭等[22]的研究表明大豆中含有4 個不同的GmUVR8蛋白質，且它們也形成了完整或不完整的七葉β-折疊的結構(圖3)。這些預測結果表明豆科植物與模式植物擬南芥的AtUVR8在序列和結構上有一定的相似度，但是又具有其獨特性。系統發育樹分析表明該蛋白與豆科植物鷹嘴豆屬于同一分支(圖4)。

2.3 紫花苜蓿過表達系黃酮醇熒光檢測

野生型和MsUVR8過表達的愈傷組織經UV-B輻射后，DPBA熒光標記檢測發現，MsUVR8過表達愈傷組織中黃酮醇含量明顯升高。原因可能是UV-B輻射促進了細胞中黃酮醇的合成(圖5)。

2.4 紫花苜蓿過表達系紫外吸收物的含量

野生型愈傷組織與經UV-B輻射后的野生型愈傷組織類黃酮物質含量無顯著差異，MsUVR8過表達愈傷組織類黃酮含量較野生型含量明顯升高，推測其原因可能是農桿菌轉化時促進了類黃酮物質的生物合成。經UV-B輻射后過表達愈傷組織的類黃酮物質含量進一步顯著升高，可能是UV-B激活了過表達的光受體MsUVR8活性，促進了類黃酮化合物的合成(圖6, A)。

花青素是紫花苜蓿組織中主要的類黃酮物質之一，經UV-B輻射后的野生型愈傷組織花青素含量高于野生型愈傷組織，經UV-B輻射后MsUVR8過表達愈傷組織花青素含量高于未經UV-B輻射的MsUVR8過表達愈傷組織，可能是UV-B輻射后激活了野生型愈傷組織內源UVR8受體活性，使花青素含量明顯升高。MsUVR8過表達愈傷組織中花青素含量高于野生型愈傷組織，說明MsUVR8過表達愈傷組織中花青素含量升高可能仍然與農桿菌浸染的刺激作用有關(圖6, B)。愈傷組織中總酚含量經UV-B輻射后均無顯著變化，過表達愈傷組織中總酚含量較野生型明顯增加，說明總酚含量僅受到農桿菌浸染的刺激促進了合成，UV-B輻射對其無顯著影響(圖6, C)。

2.5 紫花苜蓿過表達系ROS積累

UV-B輻射處理后紫花苜蓿愈傷組織褐化現象嚴重，MsUVR8過表達愈傷組織經UV-B照射后褐化現象減輕。DAB和NBT染色顯示，UV-B輻射后野生型愈傷組織過氧化氫和超氧陰離子積累增加，MsUVR8過表達愈傷組織中兩種物質積累與未經UV-B輻射的愈傷組織差異不明顯(圖7)，可能是MsUVR8增強了植物組織細胞的抗氧化性能。

2.6 過表達系UVR8信號通路效應基因轉錄分析

對UV-B信號通路相關基因的轉錄活性檢測結果(圖8)顯示，農桿菌浸染處理均促進了PAL、CHS、CHI和FLS等4種類黃酮合成相關基因的表達，UV-B輻照后野生型愈傷組織中PAL、CHS和FLS表達明顯被激活，CHI表達無明顯差異。MsUVR8過表達愈傷組織經UV-B處理后，4種基因表達活性均最大，相對其他3組表達量均顯著增強。

3 討 論

紫花苜蓿除了被用作優質牧草外，在保護生態環境、治理綠化荒地方面也具有積極作用[23]。UV-B輻射在表型結構、生理代謝、光敏形態建成等方面對植物產生著顯著影響[24]。UVR8 是目前唯一已知的植物 UV-B 特異性光受體，介導UV-B 誘導的光信號轉導途徑和光形態建成反應。但是關于 UVR8 的相關研究目前主要集中在模式植物擬南芥和水稻等作物中，在豆科植物紫花苜蓿中的研究還未見報道[25]。

本研究分離克隆得到的MsUVR8基因堿基序列和氨基酸序列與MtUVR8基因的相似度極高，MsUVR8蛋白形成不完整的折疊結構與MtUVR8 蛋白序列和結構上有一定的相似度，但又具有其自身獨特性。在大豆中也發現了同樣獨特的結構，GmUVR8蛋白形成了完整的和不完整的7葉β-折疊結構[22]。人們發現在高等植物和真核藻類細胞中都存在UVR8 蛋白，包括蘋果、大豆、單細胞藻類萊茵衣藻、苔蘚植物小立碗蘚和地錢等[26-29]。對于早期陸地植物而言，必須進化出一種保護自身免受 UV-B脅迫損傷的防御機制才能適應生長環境的變化，這種機制在由水體向陸地環境過渡的過程中得到了進化。研究表明，這種UV-B保護受體的進化史可以追溯到單細胞藻類，所有這些 UVR8 的同源物中都顯示了色氨酸的保守性和蛋白質的高度相似性[30]。由此可以看出，UVR8 具有共同的祖先。

對于紫花苜蓿較為成熟的遺傳轉化方法是農桿菌介導法。張萬軍等[31]采用農桿菌介導法將耐鹽基因rstB成功導入到紫花苜?；蚪M中。陳春艷等[32]用農桿菌遺傳轉化法篩選出苜?？剐杂鷤M織。UV-B輻射能夠促進花青素的合成，使其含量增加[33]。王靜等[34]研究表明，經UV-B照射后，紫花苜蓿幼苗類黃酮、花青素、總酚的含量均顯著提高。本實驗采用農桿菌介導法獲得了MsUVR8過表達的紫花苜蓿細胞系，結果顯示UV-B輻射后的野生型愈傷組織中總黃酮和總酚含量無顯著差異，花青素的含量明顯升高，推測其原因可能與植物類黃酮化合物的種類較多，其種類、分布與含量會因植物種類、器官、發育階段和環境生長條件的不同而異有關[35]。本研究中未經UV-B輻射的過表達愈傷組織與野生型愈傷組織相比，MsUVR8過表達的愈傷組織類黃酮、花青素、總酚物質含量明顯升高，其原因應該是在農桿菌浸染轉化過程中組織細胞受到農桿菌的刺激作用，激活了類黃酮、花青素、總酚的生物合成。低劑量UV-B輻射后，MsUVR8過表達的愈傷組織中類黃酮和花青素的含量進一步顯著升高，其原因可能是UV-B激活了細胞內過表達的UV-B光受體MsUVR8，活化的MsUVR8單體蛋白聚集于細胞核內，促進了下游靶基因的轉錄和表達。然而總酚含量無明顯變化，說明總酚含量僅因受到農桿菌的刺激作用被改變，UV-B輻射則對其無顯著影響。

黃酮醇含量檢測結果表明，紫花苜蓿MsUVR8被UV-B活化后，激活了植物內源黃酮醇的合成代謝，這些結果與前人研究一致。很多研究表明，UV-B輻射會破壞植物生物膜系統，導致植物細胞內產生大量的活性氧物質[36]。本實驗結果也發現，UV-B輻射后野生型愈傷組織過氧化氫和超氧離子積累明顯增加，而MsUVR8過表達愈傷組織中這兩種物質積累與未經UV-B輻射的愈傷組織差異不明顯，表明MsUVR8可以增強植物組織細胞的抗氧化性能，減少了UV-B脅迫對細胞引起的氧化損傷。

UVR8感知UV-B后會激活UV-B光信號通路，進而調控一系列下游靶基因的轉錄表達[37]。低劑量UV-B輻射能夠促進植物類黃酮生物合成途徑中關鍵酶基因(如CHS、PAL、CHI、FLS等)的轉錄。Park等對萵苣葉片進行基因表達差異分析發現，UV-B輻射后CHS、ANS、F3H基因的表達被顯著增強[38]。關于類黃酮合成相關基因表達檢測結果表明，農桿菌浸染處理均促進了PAL、CHS、CHI和FLS基因的表達。與未經UV-B輻射組相比，UV-B輻射后的野生型愈傷組織中PAL、CHS、FLS表達明顯被激活，CHI表達無明顯差異，而UV-B輻射后的MsUVR8過表達愈傷組織中，4種基因的表達活性均被激活，且在各處理組中基因表達水平最高，說明MsUVR8被UV-B激活后，促進了類黃酮合成相關基因的表達，激活了類黃酮合成關鍵酶的活性，提高了類黃酮物質的合成效率，增強了UV-B脅迫條件下植物愈傷組織的抗氧化能力。