施用不同根際促生菌對辣椒生長和土壤微生物群落的影響

史亞晶 史大偉 王媛媛 吳鳳芝 周新剛*

（1 東北農業大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱 150030；2 中國鐵路哈爾濱局集團有限公司農林管理所，黑龍江哈爾濱 150000）

植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是自由生活在土壤中或附生于植物根際的一類可促進植物生長、防治病害、增加作物產量、改良土壤的細菌（Helman et al.，2012；Goswami et al.，2016）。多數PGPR 可通過固氮、產生鐵載體、溶解礦物不溶性磷酸鹽、產生植物激素如吲哚乙酸、合成1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶等促生長特性（Christine &Marco，2005；Wang et al.，2018），增加土壤養分供應，提高植物根表面積和對養分的吸收能力，以及改善土壤狀況等方式影響作物的生長（Ortíz et al.，2008）。不同PGPR 菌株具有不同的促生特性，對植物的促生效應亦不同（Paungfoo et al.，2019）。

根際微生物群落的多樣性和穩定性對植物生長以及生態系統的可持續性有重要作用（Yao &Allen，2006；葛詩蓓 等，2020）。土壤微生物群落的組成與其功能有著緊密的聯系，土壤微生物群落組成的變化可能會改變群落的功能，從而對植物的適應性產生反饋作用，包括對植物的營養吸收、非生物及生物脅迫的耐受性（Sa et al.，2019）。土壤中外源施加的根際促生菌可以在植物根際存活增殖（Mandyal et al.，2012），同時會影響土壤中的常駐微生物，增強或抑制某些根際微生物的種群結構（Zhao et al.，2017）。本試驗以新羊角和辣妹子2種辣椒為試材，選用5 種PGPR 菌株，通過比較各菌株對辣椒植株生長、葉綠素和養分含量的影響，篩選出對辣椒促生效果較好的菌株；并通過高通量測序技術分析了辣椒根際微生物群落組成，研究PGPR 對根際微生物的影響，以期為PGPR 在辣椒生產上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試PGPR 菌株的培養與菌劑制備

供試PGPR 菌株為P1 貝萊斯芽孢桿菌（）、P2 暹羅芽孢桿菌（）、P23特基拉芽孢桿菌（）、P33 枯草芽孢桿菌（）、P8 銅綠假單胞菌（），均由東北農業大學設施蔬菜生理生態研究室提供。菌劑制備參考Khan 等（2019）的方法。5 種PGPR 菌株分別接種于LB 液體培養基中，收集對數生長期（OD=1）的細胞，4 ℃、7 000 r ·min溫和旋轉3 min，用0.9% NaCl 溶液洗滌3 次，然后重懸浮于無菌水中。

1.2 供試辣椒種子的滅菌與催芽

供試辣椒品種為前期試驗篩選出的對PGPR 菌株響應效果較好的新羊角（Y）和辣妹子（L）（由哈爾濱市農信種子公司提供）。挑選飽滿、無破損的種子，在10%漂白劑中浸泡30 min 進行表面滅菌，用滅菌水沖洗干凈，55 ℃水浴30 min 后置于25～30 ℃恒溫箱中催芽，出芽率達到80%后播種于育苗盤中。

1.3 盆栽試驗

2019 年4—6 月在東北農業大學園藝站人工氣候室中進行苗期盆栽試驗。

以蛭石為栽培基質，對5 種PGPR 菌株進行篩選試驗。分別對2 個辣椒品種進行接種PGPR 菌株處理和不接種PGPR 菌株處理（CK），試驗共12個處理，每個處理重復3 次，每重復5 盆，共180 盆。篩選出P1 菌株，以普通大田黑壤土為栽培基質進行試驗。分別對2 個辣椒品種進行接種P1 菌株處理和不接種P1 菌株處理（CK），試驗共4 個處理，每處理重復3 次，每重復5 盆，共60 盆。

將具2 片真葉的辣椒幼苗定植于底部有孔的花盆（直徑8 cm、高7 cm）中，每盆1 株，栽培期間每盆每次澆灌50 mL Hoagland’s 營養液，每隔24 h 澆灌1 次。試驗期間隨機更換盆栽的位置以減少試驗誤差。幼苗3～4 片真葉時，選取長勢一致的盆栽苗，分別取各菌株懸浮液10 mL 均勻澆灌辣椒根圍基質和土壤，菌液濃度為1.0 × 10CFU · mL（Yao &Allen，2006），對照澆灌10 mL 的無菌水。

1.4 植株生理指標的測定

不同PGPR 菌株處理20 d 后，分別測定辣椒植株株高、全株干質量、葉片葉綠素含量及植株全氮和全磷含量。用清水沖洗粘附在根系上的基質和土壤至干凈，吸水紙擦干后，用米尺測量植株莖基部至主莖生長點之間的距離即為株高；取植株中部全展葉，采用分光光度法測定葉片葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量；將洗凈的植株放入烘箱，迅速升溫至105 ℃，保持30 min，然后降溫至80 ℃將樣品烘干至恒重，用電子天平稱重；將烘干的植株樣品研磨，過0.3 mm 篩，再進行HSO-HO高溫消煮，采用SKALAR 流動分析儀測定植株全氮和全磷含量。

1.5 辣椒根際土壤的收集及其菌落DNA 提取

P1 菌株處理20 d 后將辣椒植株根部從花盆中輕輕取出，用手搖晃去除根系上的土壤，然后用無菌刷刷取緊貼根系的根際土壤（Zhou et al.，2019），每5 株的根際土壤混樣，-80 ℃保存備用。根際土壤菌落DNA 的提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，USA）試劑盒。

1.6 根際土壤細菌和真菌的高通量測序

在Illumina MiSeq 平臺上通過高通量測序來估計辣椒根際細菌和真菌群落組成。使用F515/R907引物擴增細菌16S rRNA 基因的V4～V5 區（Muyzer et al.，1933），用FITS1/FITS2引物對真菌rRNA基因的ITS1 區域進行擴增（Zhou et al.，2017）。PCR 擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離條帶，使用DNA 膠純化試劑盒（Agarose Gel DNA Purificaion Kit，TakaRa）對PCR 產物進行純化。將純化后的產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.7 數據分析

原始試驗數據采用Microsoft Word、Excel 2016軟件進行整理；使用IBM SPSS Statistics 21.0 軟件進行數據分析；采用Tukey’s HSD 進行方差分析，使用GraphPad Prism 5 軟件作圖。

高通量數據分析：alpha 多樣性分析使用QIIME 計算香濃指數，使用“edgeR”包的負二項式廣義對數線性模型的方法篩選與PGPR 處理的樣品間的差異OTU（Robinson et al.，2010）。使用R 軟件的“vegan”包基于Bray-Curtis 距離矩陣進行主坐標分析（PCoA）（Jin et al.，2019）。并采用PERMANOVA（也稱Adonis）分析PGPR 處理、辣椒品種以及交互作用對微生物群落組成的影響。所有序列均以生物項目登錄號PRJNA675151 收錄在NCBI-Sequence Read Archive 中。

2 結果與分析

2.1 不同PGPR 菌株對辣椒生長的影響

不同PGPR 菌株懸浮液澆灌20 d 后，除P8 菌株處理的辣妹子株高和P23 菌株處理的辣妹子干質量與對照不顯著外，各菌株均較對照顯著提高了2個辣椒品種的株高和干質量，其中P1 菌株的促進作用最強（圖1）。

圖1 不同促生菌對辣椒株高和干質量的影響

與對照相比，各菌株處理均顯著提高了2 個辣椒品種的葉片葉綠素含量和植株全氮、全磷含量。其中，P1 菌株處理顯著高于其他4 種菌株處理，促進作用最強（圖2）。因此，本試驗后續將針對P1 菌株對辣椒根際微生物的影響進行研究。

圖2 不同PGPR 對辣椒葉片葉綠素含量和植株全氮、全磷含量的影響

2.2 P1 菌株對辣椒生長及根際微生物的影響

2.2.1 P1 菌株對辣椒生長的影響 P1 菌株接種20 d 后，與對照相比，P1 菌株除了對辣妹子的株高無顯著影響外，均顯著或極顯著提高了兩種辣椒的株高和干質量（圖3）。

圖3 P1 菌株對辣椒株高和干質量的影響

2.2.2 P1 菌株對辣椒根際微生物群落多樣性的影響 P1 菌株處理對2 個辣椒品種根際細菌和真菌群落alpha 多樣性指數（OTU 數量和香濃指數）無顯著影響（圖4）。辣椒根際細菌PCoA 顯示，接菌與未接菌樣本均被分開。經Adonis 分析表明，P1 菌株對辣椒細菌群落結構有顯著影響（PERMANOVA，=0.311，=0.001），辣椒品種及其與促生菌處理的交互作用對細菌群落結構無顯著影響（PERMANOVA，Variety，=0.108，=0.091；Trt × Variety，=0.056，=0.55）；而P1 菌株、辣椒品種及其交互作用對根際真菌結構有顯著影響（PERMANOVA，Trt，=0.149，=0.001，Variety，=0.109，=0.034；Trt ×Variety，=0.116，=0.022）（圖5）。

圖4 P1 菌株對辣椒根際細菌和真菌OTU 數量和香濃指數的影響

圖5 P1 菌株對辣椒根際細菌和真菌多樣性的影響

2.2.3 P1 菌株對辣椒根際微生物群落細菌門和真菌綱水平相對豐度的影響 與對照相比，P1 菌株處理使2 個辣椒品種根際土壤細菌厚壁菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度顯著提高；新羊角根際土壤細菌酸桿菌門和浮霉菌門的相對豐度顯著降低（圖6-a）。與對照相比，P1 菌株處理使新羊角根際土壤真菌中的散囊菌綱的相對豐度顯著提高，傘菌綱的相對豐度顯著降低（圖6-b）。

圖6 P1 菌株對辣椒根際土壤主要細菌門和真菌綱相對豐度的影響

2.2.4 P1 菌株對辣椒根際微生物OTU 水平相對豐度的影響 P1 菌株處理提高了新羊角辣椒根際16 個細菌OTU 的相對豐度（圖7-a），其所在的門分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）（圖7-b），主要為芽孢桿菌屬（）、溶桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、軍團菌屬（）；降低了4 個細菌OTU 的相對豐度（圖7-a），其所在的門分別為變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria）（圖7-b），主要為甲基嬌美桿菌屬（Methylotenera）、鞘脂菌屬（）、新鞘脂菌屬（）。

P1 菌株處理提高了辣妹子辣椒根際20 個細菌OTU 的相對豐度（圖7-c），其所在的門分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和變形菌門（Proteobacteria）（圖7-d），主要為芽孢桿菌屬（）、溶桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、硝化螺旋菌屬（）、原囊菌屬（）、假黃色單胞菌屬（）、假單胞菌屬（）；降低了10 個細菌OTU 相對豐度（圖7-c），其所在的門分別為酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）（圖7-b），所在的屬分別為擬孢囊菌屬（）、芽孢桿菌屬（）。

圖7 P1 菌株對辣椒根際細菌OTU 相對豐度的影響

P1 菌株處理提高了新羊角辣椒根際的3 個真菌OTU 的相對豐度（圖8-a），其所在的門分別為子囊菌門（Ascomycota）和未分類真菌（圖8-b）；降低了10 個真菌OTU 的相對豐度（圖8-a），其所在的門分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）和未分類真菌（圖8-b），主要為柄孢殼屬（）、被孢霉屬（）、枝鼻菌屬（）、鐮刀菌屬（）、小壺菌屬（）。P1 菌株處理提高了辣妹子辣椒根際4 個真菌OTU 的相對豐度（圖8-c），其所在的門分別為子囊菌門（Ascomycota）和未分類真菌（圖8-d）；降低了5 個真菌OTU 的相對豐度（圖8-c），其所在的門分別為子囊菌門（Ascomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）和未分類真菌（圖8-d），主要為被孢霉屬（）和。

圖8 P1 菌株對辣椒根際真菌OTU 相對豐度的影響

3 結論與討論

不同PGPR 菌株的促生作用不同，它們可以通過直接和間接機制促進植物生長，并對植物生長發育、葉片光合性能和養分利用效率等生理功能有積極的影響（聶鑫和王偉，2017）。前人研究表明，PGPR 可以顯著提高辣椒植株的株高、干質量和葉綠素含量（Mandyal et al.，2012；Zhao et al.，2019）；PGPR 菌劑灌根后辣椒的株高、干質量均顯著高于未接種的對照植株（Wang et al.，2018；Abbaszadeh et al.，2019）；PGPR 菌株還可以顯著增加辣椒葉片的葉綠素含量（呂雅悠 等，2015）。本試驗中，5 種PGPR 菌株均顯著提高了新羊角和辣妹子的葉片葉綠素含量，而且P1、P2、P33 菌株顯著提高了2 個辣椒品種的株高和干質量，與前人研究結果一致。PGPR 可以使花生植株全氮、全磷含量顯著提高（韓麗珍 等，2019），本試驗中5種PGPR 菌株均顯著提高了2 個辣椒品種的植株全氮、全磷含量，這可能是因為PGPR 可以通過溶磷、固氮和解鉀的方式，促進植物對養分的吸收（Hahm et al.，2012；Sabnis &Nagraj，2015），進而增加了營養物質在葉片中的吸收和轉運，促進葉綠素合成和光合作用，進一步促進植株生長。有研究表明5種PGPR 菌株具有產生吲哚乙酸（IAA）、ACC 脫氨酶活性、鐵載體、固氮、解磷等功能，能積極促進植物吸收養分（Meng et al.，2016；聶鑫和王偉，2017；林志楷和林文珍，2019）。

作物品種也是影響PGPR 發揮有益功能的主要因素（Javed &Arshad，1997；Meyer et al.，2010）。例如，玉米雜交種能夠選擇其親本不能選擇的特定菌株，從而促進植株生長（Christine &Marco，2005）；不同小麥品種對PGPR 的響應效果也存在差異（Akbari et al.，2020）。本試驗結果表明，同一菌株對不同辣椒品種的促生效果也不同。這可能是由于不同品種根系分泌物的種類和含量存在差異，而這些根際分泌物又可以吸引不同的根際微生物并定殖到植物根際（Maria et al.，2005；Hao et al.，2010）。根際促生菌在植株根際的高效定殖，是發揮各種對植物有益功能的重要前提與否還需進一步研究驗證。

土壤微生物群落組成的變化會影響植物的生長與健康（Mendes et al.，2014）。根際細菌作為生物菌劑可以在植物根際存活增殖，也可以誘導植物根際微生物群落發生變化（Thokchom et al.，2017）。本試驗結果表明，P1 菌株處理顯著改變了辣椒根際細菌和真菌群落結構，這與Ke 等（2019）將接種在玉米根際后顯著改變土壤細菌群落結構的研究結果一致。植物根際可以通過增加有益微生物的相對豐度或減少植物病原體的相對豐度，從而促進植物生長（Bever et al.，2012）。本試驗經高通量測序分析表明，接種P1 菌株使辣椒根際擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著提高，這4 種細菌門的多數成員通常表現出促進植物生長的特性（Zhang et al.，2019）。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）種群數量是土壤健康的重要指標之一，具有潛在的生物防治能力（Zheng et al.，2020）；藍細菌門（Cyanobacteria）的多數成員能夠通過增加可溶性磷酸鹽在土壤中的積累、提高生物固氮作用的效率、增加根際可溶性鐵和鋅等物質的含量進而促進植物生長（Elkoca et al.，2007）；厚壁菌門（Firmicutes）的成員，如芽孢桿菌能夠分泌抗生素或抗菌蛋白，是眾所周知的生物防治劑（Ahimou et al.，2000）。P1 菌株還可使辣椒根際土壤子囊菌門（Ascomycota）顯著富集，其中子囊菌是土壤微生物群落結構中最重要的真菌（Hibbett et al.，2007）。

本試驗中，P1 菌株對新羊角和辣妹子的植株生長、葉片葉綠素含量、氮和磷吸收的促進效果較好，并且改變了辣椒根際細菌和真菌群落結構，提高了辣椒根際某些有益菌群的相對豐度。本試驗主要采用盆栽方式，還需進一步研究P1 菌株在田間對植株的促生效果。