草莓根腐病病原真菌Ilyonectria novozelandica的鑒定

史芳芳 褚繼萍

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆烏魯木齊 830088）

近年來，我國草莓的種植面積不斷擴大，草莓病害造成的危害也逐年加重（陳道 等，2021），其中根部病害最為嚴重，造成巨大經(jīng)濟損失，成為草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。草莓根腐病（strawberry root rot）是草莓根部重要病害之一（趙秀娟 等，2006），在世界草莓主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，主要由土傳病原真菌引起，草莓發(fā)病后植株矮小，最后全株萎蔫枯死，嚴重時可造成整個草莓生產(chǎn)園區(qū)毀滅。因此準確鑒定引起草莓根腐病的病原菌，對該病害的防治及抗病育種工作具有重要意義。

草莓根腐病是由多種病原物和環(huán)境相互作用引起的一大類病害的總稱。常見的病原菌：引起草莓黑根腐病的主要有、sp、sp（Minegish，1989；Paulus，1990）、sp（徐淑華等，2004）；引起草莓紅心（中柱）根腐病的主要有、P.E.Nelson et K.Wilhelm；引起草莓白根腐病的主要有Prill、（裘維蕃，2001；Zveibil &Freeman，2005）；引起草莓鞋帶冠根腐病的主要有（Vahl ex Fr.）Kummer（Fox，2003）等。

土赤殼屬真菌廣泛分布在木本和草本植物的根內(nèi)以及土壤中（Chaverri et al.，2011），屬于腐生真菌或弱寄生真菌。該屬大多數(shù)種類為植物病原菌，可引起植物根腐病和黑腐病等。土赤殼屬的模式種是，目前，該屬已知26 個種，包括從復合群中分出的14 個新種（Chaverri et al.，2011；Cabral et al.，2012a，2012b；Zeng &Zhuang，2013）。我國僅報道4 個種（Zhuang，2013；王玉君 等，2015），分別為、、、，都是從健康植株中分離得到的內(nèi)生菌，目前沒有從發(fā)病植株分離到土赤殼屬的致病菌。

查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)前人對草莓病害病原菌的鑒定多基于形態(tài)特征和ITS 序列，有時不能鑒定到種水平。本試驗采用形態(tài)學與多基因序列特異引物分析相結(jié)合的方法對引起草莓根腐病的病原菌進行鑒定。從草莓根部分離到該屬1 個中國新記錄種，結(jié)合形態(tài)鑒定和rDNA-ITS、-、（HIS）序列分析，對其進行形態(tài)描述和種類歸屬，明確草莓根腐病致病菌的新種類，為該病害的準確識別及綜合防治和草莓抗病育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌分離純化培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。儀器及試劑：水浴鍋，生工生物工程（上海）股份有限公司；離心機，美國賽默飛世爾公司；PCR 擴增儀和凝膠成像儀，美國BIO-RAD 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司等。PCR 擴增試劑購自廣州東盛生物科技有限公司，普通植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成及測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病植株采集 2020 年9 月在新疆第十二師農(nóng)業(yè)科學研究所草莓育苗網(wǎng)室采集紅顏草莓脫毒原原種苗發(fā)病植株，癥狀表現(xiàn)為萎蔫，坍塌在栽培基質(zhì)表面，其葉片、葉柄未表現(xiàn)發(fā)病癥狀，從形態(tài)學特征不能判斷其病原菌，需要進行實驗室病原菌培養(yǎng)進而確定其發(fā)病原因。用小鏟子從基質(zhì)槽中挖取約10 cm 帶有根系的病株，將其放入自封袋中，做好標記。后期通過人工致病性試驗和溫室中自然感病狀態(tài)進行癥狀綜合對比。

1.2.2 病原菌的分離純化 真菌的分離采用常規(guī)的組織分離法。將根部短縮莖切去表皮層，流水沖洗30 min，晾干；短縮莖用75%酒精消毒30 s，接著用無菌超純水沖洗3～5 遍；再用10%次氯酸鈉溶液消毒8～10 min，無菌超純水沖洗3～5 遍，用滅菌的無菌濾紙將短縮莖上的水吸干，將短縮莖切割成小薄片，接種于已滅菌的PDA 平板上，每個平板中放3 片，28 ℃下培養(yǎng)3～4 d。待組織邊緣部位有菌絲長出時，用接種環(huán)挑取單一菌絲轉(zhuǎn)接到PDA 平板上繼續(xù)培養(yǎng)純化，同時接種5 個平板，觀察來自5 個不同部位的菌絲生長狀態(tài)的差異性。純化3～4 次后可以得到純化的病原分離物。

1.2.3 致病性測定 12 月將紅顏草莓健康小苗種植在日光溫室營養(yǎng)缽中，種植30 d 后用無菌接種針在健康草莓植株的根部短縮莖、葉部分別扎1 個小洞，然后將另一無菌針沾取分離純化的病原菌孢子懸浮液（含孢子5 × 10個 · mL）接種到傷口處，接種后的植株置于溫室中保濕培養(yǎng)，以健康草莓植株為對照，每個處理接種2 株，對照2 株，接種7 d 后對草莓植株進行觀察。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學鑒定 按照魏景超（1979）的真菌鑒定方法進行病原菌鑒定。將長滿病原菌的PDA 平板置于4 ℃冰箱中處理1 周后，取出平板室溫放置30 min。用無菌接種針挑取PDA 平板上的少量菌絲，懸浮于滴加無菌水的載玻片上，用高倍鏡觀察病原菌分生孢子形態(tài)。從病原菌的菌絲、菌絲分枝、孢子等形態(tài)特征來進行分類鑒定。

1.2.5 病原菌的分子生物學鑒定 用PD 液體培養(yǎng)基將純化得到的單一菌株在28 ℃下?lián)u菌振蕩培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)得到的菌球用鑷子取出置于研缽中，加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，利用普通植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。首先采用真菌ITS 區(qū)域通用引物ITS1 和ITS4 對分離得到的菌株的ITS DNA 序列進行擴增，獲得1 條大小約500 bp 的DNA 片段，然后利用-基因和基因特異引物（表1）分別對DNA 進行PCR 擴增。

表1 擴增草莓根腐病病原菌不同序列的引物

25 μL 的PCR 擴增反應體系包括：1 μL（約50 ng）模板DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含Mg）、0.4 μmol · L引物各1 μL、DNA 聚合酶0.4 μL、ddHO 9.1 μL。

PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳40 min，DNA 核酸染料染色，凝膠成像儀觀察，擴增產(chǎn)物送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果登陸GenBank 進行在線BLAST 核酸同源性比對，分別下載與-和序列最相近的土赤殼屬序列以及柱孢屬和新叢赤殼屬序列共48 條（表2），以土赤殼相近種屬菌種為外類群，利用MEGA 6.0 軟件，采用NJ 鄰接法進行進化樹分析，以驗證形態(tài)學特征鑒定結(jié)果的準確性及可靠性。

表2 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹所用24 個菌株及48 個序列號

2 結(jié)果與分析

2.1 根腐病發(fā)病癥狀

用分離純化的菌株接種后，草莓短縮莖、根部均染病。病原菌先侵染須根，須根呈水漬狀，2～3 d 后葉片褪綠呈暗綠色并萎蔫，由外圍葉片向內(nèi)部葉片發(fā)展。隨著病菌進一步侵染根部，根部變黑，莖基紅褐色，直至全株枯死。近地果實亦發(fā)病，初呈水漬狀，后變褐色至微紫色，果實軟腐，潮濕時長滿白色的濃密棉絮狀菌絲。

2.2 致病性測定

通過對不同部位接種的致病性測定結(jié)果觀察可知，在接種病原菌的健康草莓根部產(chǎn)生了病原菌菌絲，沾取菌絲進行病原菌培養(yǎng)，挑取菌絲置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)重新培養(yǎng)的病原菌與原感染根腐病植株分離培養(yǎng)的病原菌菌落、菌絲等形態(tài)相同，根據(jù)柯赫氏法則判斷，確定該病原菌為草莓根腐病的致病菌。

2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

病菌在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑達3.5～4.5 cm，質(zhì)地棉毛狀，橘黃色，氣生菌絲發(fā)達，淺黃色到黃褐色，邊緣金黃色，質(zhì)地致密，邊緣規(guī)則，產(chǎn)生同心圓環(huán)帶，無滲出液。菌落背面淺黑棕色、邊緣黃褐色（圖1）。用高倍鏡（10 × 20 倍鏡）觀察病原菌孢子形態(tài)。分生孢子梗簡單或復雜，40～160 μm，通常著生于氣生菌絲側(cè)面或頂端，單一，不分枝或少分枝（圖2）。分生孢子有大小兩種，大型分生孢子豐富，圓柱形或棍棒狀，直或稍彎，（19～38）μm ×（3～7）μm。初步判斷為土赤殼屬病原菌。

圖1 病原菌菌落特征（7 d，PDA）

圖2 病原菌分生孢子梗

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

首先采用真菌ITS 區(qū)域通用引物ITS1 和ITS4對分離得到的菌株的ITS DNA 序列進行擴增，獲得1 條大小約500 bp 的DNA 片段。對該片段進行測序，并在GenBank 上進行Blast 分析，比對結(jié)果表明該病原菌菌株與土赤殼屬具有同源性。再基于-和基因特異引物進一步進行PCR擴增，獲得800 bp 和500 bp 左右的條帶（圖3）。對擴增產(chǎn)物進行測序，片段大小為843 bp 和505 bp，將測序結(jié)果登陸GenBank 進行在線BLAST 核酸同源性比對，分別下載與-和序列最相近的土赤殼屬序列以及柱孢屬和新叢赤殼屬序列共48 條，將該待測菌株-基因測序結(jié)果序列編號為ZJ16-1，基因測序結(jié)果序列編號為ZJ16-2，分別以為外類群利用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件對2 個不同基因測序序列進行分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；系統(tǒng)進化樹顯示（圖4），基于-和基因的兩個進化樹分析結(jié)果一致，具有特征條帶的菌 株 與的CBS 112593 菌株的自展支持率均為100%，據(jù)此可以進一步確定待測病原菌菌株為。

圖3 基于EF-1α 和Histone H3 基因引物序列的PCR擴增結(jié)果

圖4 基于EF-1α 和Histone H3 基因的系統(tǒng)進化樹分析

3 討論與結(jié)論

國外近兩年有關(guān)于土赤殼屬的4 個菌種、、、能 夠引起厄瓜多爾地區(qū)的安第斯黑莓黑根腐病的報道（Jessica et al.，2019）。國內(nèi)關(guān)于土赤殼屬菌種的研究均集中在健康植株上（Zhuang，2013；王玉君等，2015），未見在發(fā)病植株上發(fā)現(xiàn)該屬病原菌的報道，筆者首次在新疆地區(qū)發(fā)病植株上發(fā)現(xiàn)土赤殼屬病原菌菌種，并通過篩選特異分子序列的方法，運用分子生物學手段對草莓根腐病病原菌進行鑒定，鑒定方法快速、準確。目前，對草莓病害病原菌的判斷多基于形態(tài)特征和單一序列鑒定，而形態(tài)學鑒定耗時較長，有些類群缺乏足夠的鑒定特征。同時，使用1 個單一DNA 序列也難以成功鑒定菌種。目前常用的多基因序列分析，可實現(xiàn)對病原菌進行相對快捷、準確的菌種鑒定。但多基因序列分析需要較繁雜的分子檢測程序，對操作人員的技術(shù)水平和試驗條件的要求較高。

傳統(tǒng)檢測方法中基于形態(tài)學特征難以判斷病原菌種類，而傳統(tǒng)病原菌分子生物學鑒定引物為ITS 序列，其保守性過高，對病原菌分類結(jié)果判斷不準確，且不易將病原菌確定到某個種。本試驗選擇組蛋白H3 基因（）結(jié)合延長因子1（-）基因進行鑒定，在草莓根腐病病原菌2個特異區(qū)段的基礎(chǔ)上設(shè)計引物，獲得草莓根腐病病原菌一組特異分子檢測引物序列。一般情況下，通過PCR 擴增產(chǎn)物的電泳特征條帶即可判斷是否感染了目標菌，無需進行后續(xù)的基因測序和系統(tǒng)進化樹分析，引物特異性高，檢測準確，使得檢測程序大大簡化，方便快捷。

本試驗為首次從發(fā)病草莓根部短縮莖分離到根腐病致病菌種，在此之前未見關(guān)于該菌種在我國草莓及其他作物上致病的報道。本試驗提示并驗證了該菌種為草莓根腐病致病菌，擴寬了草莓根部病害病原菌檢測范圍，對于綜合防治草莓根腐病具有重要意義，且為該病害的準確識別及草莓抗病育種提供了理論依據(jù)。針對草莓根腐病新病原菌的發(fā)現(xiàn)，在病菌生物學特性方面尚需全面深入研究，病菌寄主范圍尚待測定，病菌侵染特性及其機制有待深入研究，以便為生產(chǎn)上病害防治提供系統(tǒng)的理論依據(jù)。