羅源地區秀珍菇栽培菌株親緣關系初步分析*

施樂樂

（福建省食用菌技術推廣總站，福建 福州 350000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 學名為肺形側耳，又名袖珍菇、姬平菇，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌目 （Agaricales） 側耳科 （Pleurotaceae） 側耳屬（Pleurotus）[1]，20世紀 90年代由中國臺灣引進內地試種并取得成功[2]。羅源縣是福建省秀珍菇主產區，2020年全縣秀珍菇產量達14.2萬噸，產值9.7億元，栽培秀珍菇成為菇農創收致富的重要途徑。目前羅源秀珍菇主栽品種主要有：秀57、秀63、秀93、秀98、秀912、臺秀122等，上述品種由不同栽培企業在不同時期從中國臺灣地區不同機構引進，經過多年繼代擴繁，栽培企業又對引進品種進行了重命名，造成羅源秀珍菇栽培品種名稱混亂，同種異名或異種同名現象極為普遍，不利于秀珍菇產業的健康發展。

近年來，分子標記技術已廣泛應用于食用菌等大型真菌的分類、鑒定，其具有模板需求量少、操作簡便、多態性高等諸多優點[3-5]，分子標記技術的出現彌補了傳統分類鑒定方法的不足，進一步提高了食用菌分類、鑒定的準確性。研究共收集羅源地區秀珍菇栽培菌株16株，并以福建農林大學菌物研究中心保藏的1株野生秀珍菇菌株為對照，通過平板拮抗試驗及RAPD、ISSR、SRAP分子標記技術對其進行親緣關系分析，以期在分子水平上為解決羅源秀珍菇栽培品種混亂問題提供數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共17株，其中16株收集自羅源秀珍菇栽培企業及菇農，另有1株為福建農林大學菌物研究中心提供。供試菌株來源信息詳見表1。

表1 供試秀珍菇菌株Tab.1 Tested strains of Pleurotus pulmonarius

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖（PD） 液體培養基：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加1 000 mL水，水煮30 min，雙層紗布過濾，濾液中加入2%葡萄糖，并補足因蒸發失去的水分，pH自然，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）固體培養基：需另加入2%瓊脂，其余成分同馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養基。

1.3 平板拮抗試驗

將不同秀珍菇菌株兩兩接種至平板中，設置3個重復，菌絲萌發后，每天觀察平板菌落交界處的拮抗情況及平板菌落形態差異情況，做好記錄統計，無拮抗記為“-”，有拮抗記“+”，“+”的數量表示拮抗的強弱。另用“*”表示菌落形態差異情況，“*”的數量表示菌落形態差異的程度。

1.4 分子標記試驗

用改良CTAB法[6]提取17個供試菌株DNA，提取后測定DNA濃度，經凝膠電泳檢測合格后，進行RAPD、ISSR和SRAP三種標記PCR。引物及反應體系見表2和表3。

表2 PCR引物Tab.2 The primers of PCR reaction

表3 PCR反應體系Ta.3 The PCR reaction system

RAPD-PCR反應程序為：94℃預變性7 min；94℃變性 1 min，34℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。

ISSR-PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，48℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。

SRAP-PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.5 數據統計和分析

在RAPD、ISSR和SRAP擴增結果電泳圖譜中，按凝膠同一位置上DNA條帶的有無進行統計，有條帶用“1”表示，無條帶用“0”表示。采用NTSYSpc-2.10e分析軟件計算樣品間的遺傳相似性系數，同時用UPGMA進行聚類分析，構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 平板拮抗試驗

不同秀珍菇菌株平板拮抗試驗結果見表4。

表4 不同秀珍菇菌株平板拮抗與菌落差異情況Tab.4 Plate antagonism and colony morphology difference of Pleurotus pulmonarius

由表4可知，菌株P916、P624、57-0、GD三代之間不存在拮抗，菌株P620和金秀之間不存在拮抗，菌株P615和X57之間不存在拮抗，菌株P626和P650之間不存在拮抗，其余菌株之間均存在拮抗；觀察不同供試菌株的菌落形態，發現供試秀珍菇菌株之間的菌落形態均存在一定差異。但平板觀察結果相對主觀，僅能作為菌株親緣關系初步判斷的依據。

2.2 分子標記試驗

對提取的17株秀珍菇菌株DNA進行RAPDPCR、ISSR-PCR和SRAP-PCR擴增，擴增所得的DNA圖譜見圖1～圖3。

圖1 秀珍菇菌株RAPD-PCR擴增DNA圖譜Fig.1 RAPD-PCR amplification of Pleurotus pulmonarius strains

圖2 引物ISSR1對秀珍菇菌株ISSR-PCR擴增DNA圖譜Fig.2 ISSR-PCR amplification of Pleurotus pulmonarius strains with primer ISSR1

圖3 引物em5-em8對秀珍菇菌株SRAP-PCR擴增DNA圖譜Fig.3 SRAP-PCR amplification of Pleurotus pulmonarius strains with primer em5-em8

由圖1～圖3DNA圖譜可知，第10泳道的P627和第17泳道的對照菌株秀2與其他供試菌株的電泳條帶差異較大，這表明P627和秀2與其他供試菌株的遺傳差異較大。

2.3 遺傳距離綜合聚類分析

計算各供試菌株的相似系數，并構建遺傳距離綜合分析聚類圖，結果見圖4。

圖4 秀珍菇遺傳距離綜合分析聚類圖Fig.4 Cluster diagram of Pleurotus pulmonarius strains

由圖4可知，17株供試菌株遺傳相似系數在0.45～1.00。當遺傳距離D為0.68時，P627和秀2各被聚為1個單一群體，其余菌株被聚為一個復合群體，這表明P627和秀2與其余供試菌株的親緣關系較遠，遺傳差異較大，除了P627和秀2外，其余供試菌株的親緣關系均較近；當遺傳距離D為1.00時（D為1，表示很可能為同一菌株），P605和P625被聚為一個群體，P916、P624、57-0、GD三代被聚為一個群體，這表明菌株P605和P625可能分屬同一菌株，菌株P916和P624、57-0、GD三代可能分屬同一菌株。

3 討論與結論

傳統的分類學鑒定方法是指在微觀和宏觀的層面上對食用菌的內部結構和外部形態進行分類鑒定的方法[7]。其通過直觀觀察的方式在一定程度上能對食用菌類群進行劃分，但由于食用菌的形態特征常因生境的不同而存在較大差異，且近緣物種間表觀特征相似，使得單純依靠傳統分類學鑒定方法鑒定食用菌存在局限性[8]。隨著生物技術的快速發展，真菌分類學家結合核酸分子生物學鑒定技術建立了更為有效的分類鑒定方法，即分子標記。分子標記能直接反映生物個體或種群間基因組的差異，因其不受材料的限制，且具有數量多、多態性高、準確性可靠、不影響生物個體目標性狀表達的特點，已被廣泛應用于食用菌的分類鑒定中。

研究通過平板拮抗試驗及分子標記技術對供試秀珍菇菌株進行親緣關系分析，試驗結果表明：P627菌株和野生對照菌株秀2與其余15株供試菌株的親緣關系較遠，而其余15株供試菌株之間的親緣關系均較近。在親緣關系較近的供試菌株中，P605和P625可能分屬同一菌株，P916和P624、57-0、GD三代可能分屬同一菌株。研究后續將會開展所有供試菌株的出菇試驗，通過供試菌株農藝性狀的比較以進一步確定各供試菌株的親緣關系。