蒼術高效液相色譜指紋圖譜的建立

白悅然，趙世津，傅業全，王建舫

(北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室/動物類國家級實驗教學示范中心，北京 102206)

蒼術為菊科植物茅蒼術(Atractylodeslancea(Thunb.) DC.)或北蒼術(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)的干燥根莖，春季、秋季采挖，除去泥沙，曬干，撞去須根[1]。茅蒼術主要分布于江蘇、湖北、河南、安徽、浙江、江西等省；北蒼術主要分布于內蒙古、河北、山西、遼寧、吉林、黑龍江等省區[2]。2020版《中國藥典》蒼術藥材質量評價僅以蒼術素含量作為標準，中藥指紋圖譜具有特征性、整體性、模糊性等特點，可充分反映中藥復雜體系中各成分的整體狀況，是目前中藥質量控制較有效的手段之一[3]。蒼術色譜指紋圖譜的方法分為薄層色譜指紋圖譜[4-5]、氣相色譜指紋圖譜[6]和高效液相色譜指紋圖譜(high performance liquid chroma-tography，HPLC)[7-13]等。高效液相色譜指紋圖譜能更全面準確反映蒼術藥材各成分的狀況，其方法中使用的流動相分為酸性[7-9]和中性[10-13]，其中酸性流動相更有利于蒼術中酸性成分的分離，中性流動相更有利于蒼術中性成分的分離，而蒼術中的酸性成分總量較少，中性成分含量較多，故該試驗采用中性流動相。該試驗旨在建立18批蒼術藥材的高效液相色譜指紋圖譜，并對結果進行聚類分析和主成分分析，以期為蒼術藥材質量評價提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

白術內酯I對照品(批號為P08J9F50979)和(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對照品(批號為M28J12S138942)均購自上海源葉生物科技有限公司。蒼術素對照品(批號為19072205)，購自成都普菲德生物技術有限公司。蒼術樣品經北京農學院園林學院田曄林鑒定，詳情見表1。

試驗儀器按照文獻[14]配備。

表1 18批蒼術樣品信息來源Tab.1 Information sources of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

1.2 色譜條件

艾杰爾-飛諾美Venusil MP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為水、甲醇和乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見表2。檢測波長270 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

表2 洗脫程序Tab.2 Elution procedure

1.3 溶液的配制

1.3.1 混合對照品溶液的制備 取白術內酯I對照品、(4E,6E,12E) -十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對照品、蒼術素對照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.22 μm的有機濾膜過濾，即可。

1.3.2 蒼術樣品溶液的制備 取蒼術藥材粉末，用孔徑270 μm濾網過濾，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)，40 ℃，1 h，放冷，再稱定，用甲醇補足損失的質量，搖勻，用孔徑74 μm濾網過濾，用孔徑0.22 μm的有機濾膜過濾，即可[14]。

1.4 方法學考察

方法學考察參考文獻[9,15]。

1.4.1 日內精密度試驗 取第8批蒼術樣品溶液，連續進樣6 次，記錄色譜圖，對所得色譜圖進行數據分析。

1.4.2 日間精密度試驗 取第8批蒼術樣品溶液，分別在0、24、48、72和96 h進樣，記錄色譜圖，對所得色譜圖進行數據分析。

1.4.3 重復性試驗 取第8批蒼術樣品溶液6份，記錄色譜圖，對所得色譜圖進行數據分析。

1.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

指紋圖譜的建立及相似度分析參考文獻[13,16-18]。混合對照品溶液和18批蒼術樣品溶液，按照“1.2”進樣，用Empower 2軟件導出AIA 格式色譜圖。相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件( 2012 版)。把第1批蒼術樣品的色圖譜設為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度0.5 min，進行色譜峰匹配。

1.6 聚類分析

聚類分析參考文獻[19-24]。以18批蒼術樣品的峰面積為變量，利用SPSS20.0 進行聚類分析。

1.7 主成分分析

主成分分析參考文獻[19-27]。以18 個共有峰峰面積為變量，利用SPSS20.0 進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 日內精密度試驗 取第8批蒼術樣品溶液，連續進樣6次，相似度均大于0.99，白術內酯I和蒼術素的保留時間的相對標準偏差分別為0.07%和0.10%，峰面積相對標準偏差分別為1.33%和1.25%。日內精密度良好。

2.1.2 日間精密度試驗 取第8批蒼術樣品溶液，分別在0、24、48、72和96 h進樣，相似度均大于0.99，白術內酯I和蒼術素的保留時間相對標準偏差分別為0.19%和0.36%，峰面積相對標準偏差分別為2.42%和1.48%。日間精密度良好。

2.1.3 重復性試驗 取第8批蒼術樣品溶液6份進行測定，相似度均大于0.98，白術內酯I和蒼術素的保留時間相對標準偏差分別為0.10%和0.13%，峰面積的相對標準偏差分別為2.41%和1.37%。重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.2.1 指紋圖譜的建立 將第1批蒼術樣品的色譜圖設為參照圖譜，進行色譜峰匹配，得到圖1的指紋圖譜，在橫坐標保留時間5 min和70 min范圍內共出現了18個共有峰。

2.2.2 共有峰確認和參照峰的選擇 將已確定的18個共有峰與混合對照品的色譜峰進行比較，指認了3個色譜峰，分別為白術內酯I( 13 號峰)、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯( 14 號峰)、蒼術素( 15 號峰)，見圖 2。

圖1 18批蒼術樣品的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

注：13是白術內酯I；14是(4E,6E,12E) -十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯；15是蒼術素。Note:13 is atractylenolide I；14 is 4e, 6e, 12e-tetradecatriene-8,10-diyne-1,3-diacetate; 15 is atractylodin.圖2 蒼術樣品(A)和混合對照品(B)HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Atractylodis Rhizoma sample(A)and mixed reference substances(B)

2.2.3 相似度評價 18批蒼術樣品的相似度在0.479～0.984之間(表3)。其中，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S14、S17和S18之間的相似度均大于等于0.811。S12除與S16的相似度達到0.945外，與其他批次的相似度均小于等于0.830。S13除與S15的相似度為0.983外，與其他批次的相似度均小于等于0.826。

表3 18批蒼術樣品相似度評價結果Tab.3 Similarity evaluation results of eighteen batches of Atractylodis Rhizoma samples

2.3 聚類分析

18批蒼術樣品HPLC指紋圖譜中的峰面積經標準化處理后，運用SPSS 20.0進行聚類分析，選擇以組間連接作為聚類方法，度量標準選擇平方 Euclidean 距離，繪制樹狀圖，所得聚類分析結果見圖3。當分類距離為20時，蒼術樣品分為2類，S12和S16聚為一類，S1～S11、S13～S15、S17和S18聚為一類。當分類距離為10時，蒼術樣品分為3類，S12和S16聚為一類，S13和S15聚為一類，S1～S11、S14、S17和S18聚為一類。當分類距離為5時，蒼術樣品分為6類，S12和S16聚為一類，S13和S15聚為一類，S5和S17聚為一類，S7～S10聚為一類，S3、S6、S14、S18聚為一類，S1、S2、S4、S11聚為一類。

圖3 18批蒼術樣品的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

2.4 主成分分析

將18批蒼術樣品的18個共有峰峰面積導入 SPSS 20.0 統計軟件進行主成分分析，以特征值1為提取標準，篩選得到5個主成分(見表4和圖4)。主成分1是5.917，主成分2是4.226，主成分3是2.885，主成分4是1.617，主成分5是1.219；這5個主成分的方差貢獻率依次為32.875%、23.477%、16.029%、8.986%和6.772%，主成分5的累計方差貢獻率達88.139%。

圖4 蒼術成分陡坡圖Fig.4 Scree plot of Atractylodis Rhizoma compoment

主成分1和峰1、峰3、峰4、峰6、峰7、峰11、峰16及峰17 的關系較為密切；主成分2和峰5、峰12、峰14、峰15及峰18的關系密切，峰14為(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、峰15為蒼術素；主成分3和峰8、峰9、峰10、峰13及峰14的關系密切，峰13為白術內酯I、峰14為(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯；主成分4和峰2及峰17的關系密切；主成分5和峰10的關系密切(表5)。

表4 蒼術主成分特征值和方差貢獻率Tab.4 Eigenvalue and variance contribution rate of Atractylodis Rhizoma compoment

3 討 論

試驗過程中發現，蒼術樣品經粉碎，常溫保存7 d后，蒼術樣品中的蒼術素含量減少，可能是蒼術樣品粉末中的揮發油成分容易揮發出來，而經甲醇萃取后，4 ℃避光保存，90 d后，蒼術樣品中的蒼術素含量基本沒有變化。

該試驗采用二極管陣列檢測器進行了190～400 nm全波長掃描。在270 nm波長處所得的色譜峰信息較為全面，可識別的化合物種類較豐富，故選擇270 nm作為檢測波長。試驗先后對0.1%磷酸-乙腈、水-乙腈和水-甲醇-乙腈作為流動相進行考察，水-甲醇-乙腈作為流動相時，出峰較多，峰型較好，且白術內酯I和蒼術素峰均得到了較好的分離。

表5 蒼術主成分的載荷矩陣Tab.5 Component matrixa of Atractylodis Rhizoma compoment

蒼術樣品S12和S16相似度為0.945，聚為一類；S13和S15相似度為0.983，聚為一類；S5和S17相似度為0.978，聚為一類；S7～S10之間的相似度均大于等于0.948，聚為一類；S3、S6、S14、S18之間的相似度均大于等于0.911，聚為一類；S1、S2、S4、S11之間的相似度均大于等于0.947，聚為一類。可見，當分類距離為5時，相似度需大于或等于0.911才能聚為一類。當分類距離為10時，S7～S10；S3、S6、S14、S18；S1、S2、S4、S11聚為一類，最小相似度為0.811。當分類距離為20時，S7～S10；S3、S6、S14、S18；S1、S2、S4、S11；S5、S17；S13、S15聚為一類，最小相似度為0.628。總之，不同批次的蒼術樣品的相似度越高，聚為一類的可能性越大，聚類的分類距離越小。

關于蒼術指紋圖譜色譜峰的指認，詹丹丹[7]指認了原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、熊果酸、綠原酸等酸性成分，而沒有指認出白術內酯I、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術素，可能因為詹丹丹用的酸性流動相，而酸性流動相更有利于酸性成分的分離。該試驗用的中性流動相，蒼術中的酸性成分在2 min 內很快被洗脫下來，所以沒有檢測到酸性成分。研究人員[8-9,13]分別建立了蒼術麩炒前后的指紋圖譜，并在270 nm處指認了蒼術素醇、(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯和蒼術素[8-9]；在254 nm處指認了共有峰白術內酯Ⅱ，鄰苯二甲酸二異丁酯、蒼術素[13]。該試驗在蒼術指紋圖譜標定的18個共有峰中，確認了3個，分別為白術內酯I、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術素。結合主成分分析可知，白術內酯I歸屬于主成分3，(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯歸屬于主成分2和主成分3，蒼術素歸屬于主成分2。

該試驗建立了蒼術 HPLC 指紋圖譜，發現18個共有峰，指認了其中3個，初步反映了蒼術整體化學特征，檢測方法簡單可行，重復性、穩定性良好，同時結合聚類分析和主成分分析多方面評價蒼術質量，為蒼術整體質量控制提供了比較全面的評價模式。