黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根際細菌多樣性分析

崔文文，劉夢儀，陳海霞，王雪蓮，朱 華，張 蓉，崔金騰*

(1.北京農學院園林學院，北京102206；2.北京市農林科學院水產科學研究所，北京100068)

河流污染是目前中國面臨最常見的環境問題之一，河道底泥富集大量的有害物質，會導致水質急劇惡化，魚類及其他生物大量死亡。傳統的水污染治理方法主要有控制外源性和內源性營養物質[1]等，但是這些方法耗資大，且無法針對不同水體的整體特性進行綜合治理，而以水生植物、細菌為主的生物治理方法能有效降低污染程度，適用范圍廣，經濟成本低，不會對水體造成二次污染。特別是以植物與細菌為基礎的聯合修復技術不但可以降低污染水體中的污染負荷，而且能夠有效降低河道底泥的污染，在應用過程中還可以獲得一定的經濟效益，因此，水生植物-細菌聯合修復技術被應用于越來越多的水體治理項目中[2]，成為治理富營養水體最有發展前景的技術。魏瑞霞等[3]在唐山市南湖公園用植物浮床-細菌修復富營養化水體，基本解決南湖公園水體的污染問題；鄒萬生等[4]利用苦草、菹草和細菌以及水芹菜、水蔥和細菌凈化珍珠蚌養殖廢水取得較好的凈化效果。研究表明，水生植物根系分泌物及環境因素會直接影響根際細菌群落結構，根際細菌群落結構又會影響細菌的功能[5]，進而影響到對污染水體的凈化效果。同時，植物通過根系吸收、降解有害物質，但植物與細菌種類不同其凈化效果差異很大，因此，研究不同植物-細菌體系對水體的凈化功能具有重要意義。

該研究將黃菖蒲種植在用河道底泥配置的水體中，添加枯草芽孢桿菌處理，構建黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系，利用16S rDNA測序技術分析該凈化體系根部細菌的多樣性變化，以探究黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系在河道底泥的凈化效果，為水生植物-細菌聯合修復水體提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年8月20日從沙河上游河道挖取河道底泥。選擇生長健壯、無病蟲害、生長期一致的黃菖蒲(Irispseudacorus)72株。從中國普通細菌菌種保存管理中心購置枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisBE_91)菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備枯草芽孢桿菌菌液 采用LB液體培養基培養枯草芽孢桿菌，恒溫培養搖床設定200 r/min、37 ℃，12 h取出菌液。在560 nm的波長下，測定枯草芽孢桿菌菌懸液的吸光度，定容菌懸液OD560 nm=0.8，放入冰箱備用。

1.2.2 試驗材料的樣本分組與處理 將采集的河道底泥分成7份，每份5 L。其中1份作為對照組；3份置于花盆中，分別加入1 000 mL去離子水攪拌均勻并標記水位，作為黃菖蒲組；3份置于花盆中，分別加入2 00 mL枯草芽孢桿菌菌液和800 mL去離子無菌水攪拌均勻并標記水位，作為黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組。每組處理均為3次重復。

2019年9月9日栽種黃菖蒲，對照組、黃菖蒲組和黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組每盆種植8株黃菖蒲，置于25 ℃日光溫室中培養，根據水分蒸發情況，用去離子無菌水補充蒸發損失至標記水位。生長到第42天，采集黃菖蒲組和黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組的黃菖蒲根部底泥，各處理組3次重復，均取根部底泥50 mL置于無菌PC管中，-20 ℃保存、備用。將試驗分為第0天對照組(DAY0)、第42天黃菖蒲組(DAY42CK)和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組(DAY42BS)。

1.3 根部細菌DNA提取和測序

使用天根生化科技(北京)有限公司生產的土壤基因組DNA提取試劑盒(DP336)，提取第0天對照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組根部底泥的DNA，并純化總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性，提取的DNA于-20 ℃保存、備用。

將檢測合格的DNA利用16SrDNA V4區段引物進行PCR擴增，引物為515F/806R(515F是5′-CAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R是5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[6]。DNA擴增條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環，72 ℃延伸5 min。建庫和測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，采用HiSeq測序平臺進行高通量雙端測序。

1.4 生物信息學分析

使用合并配對端(V1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)[7]對每個樣本的測序進行拼接，得到的拼接序列為原始序列數據，參照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)[8]的序列質量控制流程處理得到高質量的序列數據(Clean Tags)[9]。再將序列通過矢量化搜索(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Effective Tags)[10]。利用代表性序列鑒定算法(Uparse Tags)軟件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對所有樣本的全部有效序列進行聚類，以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為可操作的分類單元，采用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)[11]的SSUrRNA數據庫[12]進行物種注釋。

1.5 數據統計和分析

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算物種種類指數，菌群多樣性指數，樣本多樣性指數；樣本多樣性指數組間差異分析采用威爾科克森秩和檢驗方法分析，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。無度量多維標定法統計組間細菌群落結構差異，用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Unifrac距離(多樣本的群落比較方法)、構建非加權組平均法樣本聚類樹。利用顯著性差異分析的方法對組間的物種豐度數據進行假設檢驗，應用線性判別分析處理組間差異性物種。應用Tax4Fun，以SILVA數據庫序列為參考序列聚類出聚類和物種分類，進而獲取功能注釋信息。

2 結果與分析

2.1 黃菖蒲根部底泥細菌測序數據分析

將測序原始下機數據進行拼接和質控，過濾低質量和短長度序列后得到清晰序列，其中第0天對照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組樣本的清晰序列數分別為193 250條、186 947條和178 127條。進行嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效序列，然后對所有樣本的有效數據以97%的一致性進行聚類分析，分別得到4 668個序列、4 250個序列和4 953個序列(表1)。

表1 黃菖蒲根部底泥細菌16SrDNA測序數據Tab.1 16S rDNA sequencing data of bacteria in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

2.2 黃菖蒲根部底泥細菌多樣性分析

2.2.1 黃菖蒲根部底泥細菌多樣性指數 黃菖蒲根部底泥細菌多樣性指數見表2與圖1。3個處理組樣本間的物種數目在2 924～3 150之間，相差不大，說明檢測到的聚類數量無顯著差異。將黃菖蒲根部底泥細菌多樣性繪制為韋恩圖。3個處理組樣本間的共有細菌2 919種。除去共有細菌外，第0天對照組細菌1 749種；第42天黃菖蒲組細菌1 331種；第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組細菌2 034種。第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組細菌多樣性的值高，進而說明黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系有效改變底泥群落多樣性狀況。在菌群多樣性中，第0天對照組、第42天黃菖蒲組的指數相差不大，說明黃菖蒲培養42 d后，沒有改變底泥中的細菌多樣性。在菌群豐度指數中，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組明顯高于第0天對照組、第42天黃菖蒲組，說明黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系有效改變底泥群落多樣性狀況。

表2 黃菖蒲根部底泥細菌α多樣性指數Tab.2 Bacterial α diversity index in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

圖1 黃菖蒲根部底泥細菌多樣性Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacterial diversity inrhizosphere sediment of Iris pseudacorus

2.2.2 黃菖蒲根部底泥細菌在門分類水平上的分布 根據物種注釋結果，選取每個分組在門水平上較大豐度的前10名，生成物種相對豐度柱狀累加圖，如表3所示。第0天對照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組在門水平上都以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)為主，其中明顯優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)。

表3 門水平上黃菖蒲根部底泥細菌群落組成Tab.3 Bacterial community composition in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus at the phylum level

2.2.3 黃菖蒲根部底泥細菌群落結構差異 第0天對照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組組間細菌群落結構位置分布明顯不同，經過42 d的培養黃菖蒲對底泥樣本中的細菌群落結構產生影響(圖2)。第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組的位置分布存在明顯的差異，說明枯草芽孢桿菌同樣對底泥樣本的細菌群落結構產生影響，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中的枯草芽孢桿菌通過營養和空間兩方面的競爭形成區域優勢菌群，抑制有害細菌的生長繁殖，從而達到改變底泥樣本中細菌群落結構的效果。

圖2 黃菖蒲根部底泥細菌群落無度量多維標定法分析Fig.2 NMDS analysis of bacterial community in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

2.2.4 黃菖蒲根部底泥細菌組間差異線性判別分析 選取線性判別分析閾值大于4的物種分析作圖，如圖3所示。

第0天對照組和第42天黃菖蒲組差異比較發現(圖3A)，第0天對照組，厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭狀芽胞桿菌綱(Clostridia)、梭狀芽胞桿菌目(Clostridiales)和丙酸桿菌目(Propionibacteriales)的相對豐度具有顯著差異。第42天黃菖蒲組，擬桿菌門(Bacteroidetes)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)和噬氫菌界(Hydrogenophilaceae)的相對豐度具有顯著差異。

圖3 黃菖蒲根部底泥細菌群落線性判別分析值分布Fig.3 LDA value distribution of bacterial community in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

第0天對照組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組差異比較發現(圖3B)，第0天對照組，放線菌門(Actinobacteria)、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)和諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)的相對豐度具有顯著差異。第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中，擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、噬氫菌科(Hydrogenophilaceae) 的相對豐度具有顯著差異。

第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組差異比較發現(圖3C)，在第42天黃菖蒲組中，伯克氏菌科(Burkholderiaceae)的相對豐度具有顯著差異；在第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中，擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和擬桿菌目(Bacteroidales)的相對豐度具有顯著差異。

2.2.5 黃菖蒲根部底泥細菌功能相對豐度聚類分析 黃菖蒲根部底泥細菌功能相對豐度聚類分析見圖4。根據各個樣本中細菌功能聚類分析的熱度值，第0天對照組底泥中的細菌優勢功能具有發酵作用和化能異養的作用；第42天黃菖蒲組中黃菖蒲根部底泥細菌優勢功能具有硫酸鹽呼吸作用和硫化物呼吸作用；第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中黃菖蒲根部底泥細菌優勢功能具有硝酸鹽還原、銨硫化物氧化、吸收氮元素和通過呼吸作用代謝硝酸鹽。各個時期的優勢菌均有差異，其中黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組42 d的優勢菌有較強的代謝底泥中硝酸鹽和吸收氮元素的能力，含氮元素的鹽類物質中，尤其是NH4+對水中動物的毒害能力很強，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組菌群對NH4+的處理能力明顯強于未處理過的第0天對照組。

圖4 黃菖蒲根部底泥細菌功能注釋聚類熱圖Fig.4 Functional annotation cluster heat map of bacteria in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

3 討 論

黃菖蒲[13]是鳶尾科多年生挺水植物，在中國各地均有栽培，喜生于河湖沿岸的濕地或沼澤地，近年常用于園林綠化。黃菖蒲生物量大、適應性強，根系發達，有較強的輸氧能力，可以產生好氧環境。水生植物對環境的修復作用主要有植物的吸收、吸附、富集作用和根際細菌的降解作用，其中根際細菌在修復過程中發揮更為重要的作用。細菌[14]通過降解有機物和代謝作用將富營養水體中的一些復雜有機物轉化為簡單無機物，并從污染物中獲取新陳代謝的能量[15]。研究表明，植物的種植會對原生細菌有一定促進作用，植物會使優勢菌種相對豐度發生改變，同時提高原生細菌的豐度與多樣性[16]。

該研究基于諾禾致源HiSeq測序平臺對黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根部細菌多樣性進行分析，16S rDNA測序結果表明，黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根部細菌群落多樣性和豐富度較高，共檢測到52個優勢菌門，各處理組的優勢菌門差別較大，表明黃菖蒲和黃菖蒲-枯草芽孢桿菌[17]凈化體系在不同程度上改變根部底泥的細菌多樣性組成。Alpha多樣性指數差異性檢驗分析表明，黃菖蒲沒有對底泥中細菌聚類數量、群落豐富度和多樣性造成顯著的影響，但是黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系有效改變底泥細菌群落多樣性狀況。該試驗在黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根部細菌的群落結構方面，經過42 d的處理，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組和第42天黃菖蒲組都使底泥中細菌群落結構出現差異，且第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組差異較第42天黃菖蒲組更加明顯。

枯草芽孢桿菌具有凈化水體的功能[18]，能夠產生多種抗菌素和酶，抑制有害細菌生長繁殖，并促進河流污染物的降解。黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系中，根部底泥大量富集能還原硝酸鹽、氧化銨硫化物、吸收氮元素和代謝硝酸鹽的細菌類群，其優勢菌具有硝酸鹽還原、銨硫化物氧化、吸收氮元素和通過呼吸作用代謝硝酸鹽的功能，含氮元素的鹽類物質中，尤其是NH4+對水中動物的毒害能力很強，黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組菌群對NH4+的處理能力明顯強于未處理過的第0天對照組，并且黃菖蒲-枯草芽孢桿菌聯合修復底泥污染能取得比僅用黃菖蒲更好的凈化效果。黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系對降低河道底泥和污水中銨類物質有較強的潛在能力，對恢復河流物種多樣性有較好的應用前景。