成骨細胞在不同因素影響下黏附作用的研究進展

梁文強，楊國清，張懷斌，謝犇，楊杜斌，王勇平，2

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730030； 2.蘭州大學第一醫院骨科，蘭州 730030)

骨缺損是目前骨科面臨的難題之一，應用生物材料修復骨缺損是臨床和組織工程研究的熱點，同時生物材料需具備較強的促成骨能力。在成骨細胞與生物材料相互作用過程中，黏附是促進細胞與材料相互作用的重要起始步驟。但是成骨細胞的黏附過程涉及一系列由細胞到分子水平的復雜生理過程和物理化學變化[1]。越來越多的證據表明，成骨細胞在生物材料上的黏附是將生物物理化學信號傳遞給成骨細胞的關鍵步驟，從而啟動骨整合級聯反應，調節成骨細胞與生物材料之間的相互作用[2-4]。其中生物材料的表面形態、表面涂層、復合材料、孔隙結構等均可不同程度地促進成骨細胞黏附。成骨細胞黏附于生物材料的過程不僅是簡單的物理過程，還涉及啟動和調節細胞存活、遷移等重要過程。這些都是早期成骨細胞黏附的重要組成部分，導致成骨細胞直接附著在生物材料表面，而不需要軟組織或結締組織的干預[5]。隨著研究的逐漸深入與組織工程的發展，越來越多的研究證實生物因素、等離子體以及中醫藥在促進成骨細胞黏附方面有一定作用。諸多因素對成骨細胞黏附產生一定的促進作用。現就成骨細胞在不同因素影響下黏附作用的研究進展進行綜述。

1 生物材料表面特性對成骨細胞黏附的影響

不同的生物材料對成骨細胞的黏附具有一定影響，而且成骨細胞在生物材料上的黏附也受到生物材料的影響。生物材料的表面形態、表面電荷、孔徑大小和表面生物活性等物理化學性質對成骨細胞的黏附過程有重要影響，從而影響早期成骨細胞黏附。

1.1表面形態 從微米級到納米級的表面形態可以影響成骨細胞的黏附。骨組織表面的粗糙度約為32 nm，骨生物材料中的納米級粗糙度也能對成骨細胞的黏附產生影響。當表面粗糙度達到納米級后成骨細胞的黏附能力顯著提升，這與納米級的波峰使局部負電荷濃度增加進而吸附更多的纖維連接蛋白有關[6-7]。粗糙的表面增加了成骨細胞早期與材料表面的連接，更有利于細胞的黏附[8-9]。這進一步促進了細胞外基質的分泌，有利于細胞的長期黏附。但表面粗糙度>2.19 μm時，成骨細胞的黏附作用會受到一定抑制，其原因可能是過大的粗糙度導致從凸起到凹槽的距離變長，不利于成骨細胞偽足的形成[10]。Anselme等[11]研究了不同粗糙度對成骨細胞黏附的影響，發現材料表面凹槽深度加深、寬度增加可以促進細胞黏附。Eghbali等[12]使用光纖刻蝕激光裝置對Ti-6Al-4V合金板材進行表面改性，并與MG-63細胞共培養后發現，當激光頻率為20 kHz、刻槽距離為50 μm時，改性樣品的細胞存活率較未處理樣品提高了35%，當溝槽距離>50 μm時，最小激光頻率(20 kHz)可減小激光脈沖的重疊，提高細胞黏附性。

上述研究表明，成骨細胞黏附可能存在最佳粗糙度。適宜的表面粗糙度可為成骨細胞提供足夠的凹槽用于細胞定位和拉伸，有利于吸收更多黏附相關蛋白以促進細胞黏附。因此，可以通過物理化學的方法增加材料的表面粗糙度，達到促進成骨細胞黏附的目的。

1.2表面涂層 將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸固定在生物材料表面，可以促進成骨細胞的黏附。Verstappen等[13]將支撐脂雙層膜進行精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸功能化，實現了成骨細胞前黏附和增強分化。Man等[14]制備了一種功能性Ti-6Al-4V合金，并將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸與功能性Ti-6Al-4V合金結合，發現功能性Ti-6Al-4V合金支架更有利于成骨，這可能是由于涂層在Ti-6Al-4V合金上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽提高了成骨細胞的黏附性。通過精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽在Ti-6Al-4V合金表面共價交聯形成功能性Ti-6Al-4V合金，可以增強成骨細胞的黏附和鋪展，進而促進堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原基因的表達。李鶯等[15]在純鈦表面制備TiO2納米管涂層后，與Ⅰ型膠原結合發現，成骨細胞伸展完全，細胞骨架結構明顯，黏附斑蛋白表達增加，促進了成骨細胞在該材料表面的黏附，表明純鈦表面TiO2納米管結合Ⅰ型膠原可有效促進骨細胞黏附，進而促進骨整合。俞斌等[16]通過實驗發現，Fe3O4多巴胺涂層修飾的聚對苯二甲酸乙二醇酯人工韌帶材料可以明顯增加成骨細胞的黏附。Haag等[17]將牛血清白蛋白溶解到不同濃度的CaCl2溶液中制備成表面涂層，將涂層復合到聚苯乙烯中，研究其對MC3T3-E1細胞的影響，結果發現，鈣修飾的牛血清白蛋白可改善MC3T3-E1成骨樣細胞的整體黏附，但過高濃度的鈣會誘導細胞死亡。Xu等[18]為了提高鈦的抗污性和生物活性，采用兩性離子聚2-(甲基丙烯酰氧基)乙基膽堿磷酸酯[zwitter ionic poly 2-(methacryloyloxy)ethyl choline phosphate，PMCP]通過表面引發原子轉移自由基聚合對鈦表面進行改性，實驗發現，Ti-PMCP表面具有兩性離子防污性能，降低了血清白蛋白和纖維蛋白原的吸附性，Ti-PMCP參與鈦表面PMCP和細胞膜上磷酸膽堿的相互作用。因此，Ti-PMCP表面可促進MC3T3-E1細胞與骨髓間充質細胞的黏附和增殖。

材料表面增加涂層是促進成骨細胞黏附的一種較為常用的方法，性狀優良的表面涂層不僅可以增強成骨細胞在材料表面的黏附，還能促進成骨細胞的增殖。不同的表面涂層可使不同的黏附相關蛋白表達增加，激活信號通路，但這一過程中涉及的分子機制研究較少。

1.3復合材料 利用各種材料的不同特點制作的復合材料能夠實現優勢互補，使材料具有更好的細胞黏附性、細胞增殖以及生物相容性。Zhang等[19]制備了一種多孔聚醚酰亞胺支架，該支架的相對細胞黏附能力和細胞形態均優于聚醚酰亞胺和Ti-6Al-4V。Szewczyk等[20]開發了聚偏二氟乙烯薄膜，以獲得表面仿生細胞外基質，在成骨細胞黏附和增殖的細胞培養研究中發現表面粗糙的薄膜能明顯提高成骨細胞的黏附力[18]。Ghezzi等[21]提出了3-巰丙基三甲氧基硅烷對碳化硅納米顆粒的功能化處理，功能化納米線的黏附性優于裸露納米顆粒，細胞骨架顯示蛋白分布更均勻，同時基因表達分析顯示，堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原的表達水平較高。廖健等[22]將大鼠成骨細胞接種于煅燒骨/殼聚糖復合材料上，培養3 d后成骨細胞緊密黏附于煅燒骨與殼聚糖質量比為1/2、1/1、2/1的復合材料表面，伸展完全，胞體豐滿并伸出偽足嵌入材料內部；培養7 d后細胞鋪滿材料表面，其中煅燒骨/殼聚糖質量比為2/1的復合材料表面的細胞最密集，表明煅燒骨/殼聚糖復合材料可增加成骨細胞的黏附與增殖。殼聚糖與成骨細胞具有良好的生物相容性，能夠促進成骨細胞的黏附，脫細胞骨基質也有良好的生物相容性且能起到骨傳導與誘導的作用，因此聯合堿性成纖維細胞生長因子制備成復合支架：堿性成纖維細胞生長因子/脫細胞骨基質/殼聚糖支架，復合支架有利于成骨細胞的黏附，可促進成骨細胞的移植與成骨基因的表達[23]。研究發現，將人成骨樣SAOS-2細胞接種于糖交聯膠原-羥基磷灰石顆粒支架材料表面，人成骨樣SAOS-2細胞能夠伸展偽足遷移入支架材料內部黏附生長[24]。有文獻報道，在富含SiO2的生物玻璃材料中加入MgO可以產生良好的化學環境，誘導吸附在表面的蛋白質構象發生變化，促進參與細胞黏附蛋白的表達，對細胞的黏附行為產生積極影響[25]。Liu等[26]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物為載體，制備了成骨誘導劑緩釋系統，并將其包覆在鈦表面，與成骨細胞共培養后發現，PLGA+成骨誘導劑組的成骨細胞呈典型的紡錘形，數量較多，提示PLGA+成骨誘導劑可促進成骨細胞的黏附和增殖。

復合材料的優點在于能將不同材料的優良性狀相結合，由于不同材料的理化性質存在差異，復合材料的制備過程較為復雜，但優良的復合材料可促進成骨細胞的黏附和增殖。

1.4孔隙結構 研究發現多孔鉭有利于成骨細胞在其表面及孔隙內黏附，整合素β1及纖維粘連蛋白在成骨初期鉭-骨界面表達增高，可能對早期成骨起促進作用，而在骨成熟期則表達降低，有利于成骨細胞黏附及改建[27]。Wang等[28]通過實驗發現隨著材料表面孔徑的增大，F-肌動蛋白和堿性磷酸酶顯著增加，成骨相關基因骨形態發生蛋白2、骨鈣蛋白、Runt相關轉錄因子2重組蛋白和堿性磷酸酶顯著上調，表明類松質多孔結構可以有效降低金屬材料的彈性模量，從而避免應力集中，促進成骨細胞的黏附和增殖。O′Brien等[29]研究生產了一系列具有不同孔徑和細胞附著比表面積的支架，細胞附著與支架比表面積之間存在線性關系，表明在所研究的孔徑范圍內(95.9～150.5 μm)，MC3T3-E1細胞的短期活性取決于可結合的比表面積。孔隙的直徑對成骨細胞的黏附過程有一定影響，材料的直徑對于成骨細胞黏附同樣具有一定促進作用，徐玲和于衛強[30]研究了不同的TiO2納米管對成骨細胞黏附的影響，實驗結果顯示，與直徑為80 μm的納米管相比，直徑為30 μm的納米管成骨細胞能更好地黏附在50 μm的納米管上，說明成骨細胞的黏附受納米管直徑的影響。材料表面搭載一定的藥物涂層對成骨細胞的黏附同樣具有影響。

隨著人們對成骨細胞黏附認識的深入，成骨細胞黏附不再局限于細胞在生物材料表面的物理黏附，而是一個復雜的生理過程。成骨細胞黏附除了能將成骨細胞物理附著在生物材料表面外，還能激活信號通路，控制細胞的存活、增殖、遷移和分化等一系列重要的活動。成骨細胞黏附的調控不應僅局限于物理黏附，也應關注其涉及的信號通路，將生物材料表面產生的生物物理化學信號傳遞到細胞內，激活下游信號通路，調節早期骨整合。研究不同生物材料的表面性質對黏附相關蛋白的影響具有重要意義，但對于材料激活的黏附相關信號通路與早期骨整合之間的關系仍不明確，忽視黏附在介導下游信號通路中的重要作用可能會導致早期骨整合的失敗。未來應關注生物材料的物理附著和介導的信號通路，以促進早期骨整合。

2 生物因素對成骨細胞黏附的影響

在生物材料表面改性的研究中生物因子被廣泛用于支架表面改性，其原因是生物因素本身具有促進成骨細胞黏附的作用。李娜和章非敏[31]分別在多巴胺改性、多巴胺復合Ⅰ型膠原改性的玻片和空白玻片上培養MC3T3-E1細胞，實驗結果表明相對于空白玻片組，MC3T3-E1 細胞在多巴胺以及多巴胺復合Ⅰ型膠原組中鋪展、黏附形態更好，表明多巴胺及多巴胺復合Ⅰ型膠原可促進成骨細胞的黏附作用。宋婷婷[32]實驗發現，成骨細胞特異性識別多肽能促進成骨細胞的黏附與遷移。有研究指出，重組人甲狀旁腺激素對成骨細胞的黏附具有促進作用[33]。

3 等離子體對成骨細胞黏附的影響

等離子體是一種通過電離產生的離子化氣體狀物質，分為熱等離子體和低溫等離子體兩大類，通常用于材料表面改性和組織再生領域。Gonzalez-Blanco等[34]在鈦片上添加硅涂層并進行酸化處理后，用氬等離子體處理材料，與人成骨MG-63細胞共培養后發現，與未經氬等離子體處理的鈦片相比，經氬等離子體處理的鈦片上培養的細胞黏附和增殖水平更高、線粒體損傷更小、平均細胞面積更大。有實驗發現，無機牛骨通過氬氣+5%氧氣產生的低溫氬氧等離子體進行表面活化細胞鋪展較為充分，細胞表現出較好的黏附性[35]。Ghezzi等[36]設計了碳化硅和核殼碳化硅/二氧化硅納米顆粒并研究其對小鼠成骨MC3T3-E1細胞的影響，經過氫等離子體處理后，碳化硅納米顆粒的親水性增加，碳化硅納米顆粒表面潤濕性的改善使接種后24 h的細胞黏附性更好，細胞呈扁平狀和星狀，親水性的增強可能導致蛋白質吸附的增加。等離子體通過改變材料表面的不同性狀增加了細胞黏附的能力。

4 中藥對成骨細胞黏附的影響

近年基于中醫藥的研究不斷深入，中藥材對于成骨細胞的生物學行為具有一定影響。林煜等[37]研究了健骨顆粒含藥血清對成骨細胞黏附的影響，結果發現隨著含藥血清干預時間的延長，成骨細胞表達及分泌的纖維粘連蛋白、Ⅰ型膠原、玻連蛋白、黏著斑激酶信使RNA及蛋白水平逐漸升高，提示健骨顆粒能促進成骨細胞的黏附，原因在于其激活了介導成骨細胞黏附的黏著斑激酶轉導通路各相關因子，使成骨細胞進入“分泌增加→黏附增加→功能增強、分裂增殖→分泌增加”的良性循環，對成骨細胞的成骨效應起正性調節作用。有研究表明，淫羊藿苷去蛋白無機牛骨復合材料表面能使成骨細胞黏附增多、分布更加均勻[38]。宋立成等[39]分析淫羊藿苷對高重力加載后細胞黏附和細胞骨架的影響發現，一定條件下的重力和淫羊藿苷干預均可促進成骨細胞黏附。

5 小 結

近年有關成骨細胞黏附的研究較多，許多研究結果顯示成骨細胞的黏附是一個復雜的過程，生物材料的各種性質、生物因素、等離子體和中醫藥均會對其產生一定影響。良好的骨生物材料應具備良好的生物相容性、細胞附著性、細胞增殖性等。材料的表面特性如表面形態、表面涂層、孔徑的大小以及復合材料均可能對成骨細胞的黏附產生一定影響。但成骨細胞在生物材料上黏附過程的調節和所涉及的信號通路可能更為復雜。促進成骨細胞在骨生物材料上的黏附還需要更多的體外與體內實驗研究。隨著對促進成骨細胞黏附的進一步研究，可以為臨床實踐中骨缺損患者的治療提供理論與實踐依據。