結直腸癌周期蛋白E和生存素的表達及臨床意義

張勁遠，何磊，劉遠成，李永海，張承岳，徐烈娟，李瑞

(安徽醫科大學附屬第三醫院 合肥市第一人民醫院 a.普外科，b.中醫肛腸科，c.胃腸外科，合肥 230061)

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，據統計，全球每年結直腸癌新發病例超過50萬[1]。隨著我國人民生活水平的不斷提高、飲食結構的改變，結直腸癌的發病率呈上升趨勢，已成為近十幾年來發病率較高的惡性腫瘤之一，且尤以經濟較發達地區發病率較高[2]。隨著生物分子學研究的不斷發展，研究顯示，結直腸癌的發生與多個癌基因的激活以及抑癌基因的失活密切相關[3]。結直腸上皮黏膜腺體以及間質成分細胞的增殖調控異常在結直腸癌的發生發展中發揮重要作用[4]，如周期蛋白E，其作為細胞正向周期調節因子，可通過促進中心體的過度增殖、干擾有絲分裂以及染色體的形成等促進腫瘤的發生發展[5]。生存素作為抑制凋亡基因家族成員之一，可抑制細胞凋亡而促使腫瘤生長[6]。研究表明，結直腸癌中生存素的表達與組織分化程度、淋巴結轉移及Dukes分期密切相關[7]。本研究主要從生物學角度，通過免疫組織化學方法檢測周期蛋白E和生存素在結直腸癌組織中的表達，探討兩者與結直腸癌生物學病理因素的相關性，以期為結直腸癌的早期診斷及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年9月在安徽醫科大學附屬第三醫院進行手術切除治療的60例結直腸癌患者的結直腸癌組織。其中男32例、女28例，年齡36～90歲，平均(58±6)歲。患者在取樣前均未接受放療和化療，所有組織的選取位置距離癌變部位10 cm以上。依據《消化系統腫瘤病理學和遺傳學》[8]作為參考，組織分化：低分化12例、中分化17例、高分化31例；Dukes分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期30例、Ⅲ期24例、Ⅳ期3例；未發生淋巴結轉移者33例，發生淋巴結轉移者27例；腫瘤浸潤位置：黏膜層6例、肌層6例、漿膜層48例。選取同期進行結直腸外科手術的30例非結直腸癌患者的正常結直腸組織作為對照，其中男17例、女13例，年齡38～75歲，平均(58±5)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法 使用10%的中性甲醛固定標本，對其包埋切片，連續切片的厚度為3～4 μm，采用Envision兩步法進行免疫組織化學染色。選用0.01 mol/L、pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗切片，清洗3次，每次3 min；將選取的組織抗原放置微波爐內進行加熱修復。每張切片均加入1滴過氧化酶阻斷溶液，在室溫條件下進行孵育，時間為10 min。PBS沖洗3次，去除PBS，在切片下滴入1滴正常的非免疫動物血清，在室溫條件下孵育，時間為10 min。將血清去除，在切片上滴入鼠抗人周期蛋白E抗體，室溫條件下孵育60 min，再使用PBS清洗3次，每次3 min。在切片上滴入生存素單克隆抗體，室溫下孵育3 min，PBS沖洗。每張切片上加入2滴新鮮配制的二氨基聯苯胺顯色劑，將其放置顯微鏡下觀察3～10 min。使用自來水將其沖洗，蘇木精進行復染，使用自來水或PBS沖洗，對于二氨基聯苯胺顯色的切片，每張切片需要使用梯度乙醇脫水干燥，使用中性樹膠進行封固。

1.3免疫組織化學染色結果判斷標準 腫瘤細胞周期蛋白E和生存素在免疫組織化學陽性反應中呈棕黃色顆粒，周期蛋白E定位于細胞核，生存素主要定位于細胞質，少數在細胞核，陽性定義為著色細胞≥10%。

免疫組織化學染色結果的判斷標準：采用雙盲試驗法，分別由兩名經驗豐富的病理醫師進行閱片。結果判斷參照Kawasaki等[9]制訂的半定量積分標準：顯微鏡下觀察，若組織細胞出現淡黃色或棕黃色顆粒，則為陽性細胞。選取10個高倍視野組織，按照組織中陽性細胞百分比計分：若陽性細胞的細胞數<5%，記為0分；5%≤陽性細胞數<25%，記為1分；25%≤陽性細胞數<50%，記為2分；50%≤陽性細胞數<75%，記為3分；陽性細胞數≥75%，記為4分。按照著色程度計分：組織染色呈現淡黃色，記為1分；組織染色呈現黃色，記為2分；組織染色呈現棕黃色，記為3分。將兩個計分結果相乘，即可得出陽性強度：0分為陰性、1～4分為弱陽性、5～8分為中度陽性、9～12分為強陽性。

2 結 果

2.1正常結直腸組織與結直腸癌組織中周期蛋白E、生存素的表達情況 結直腸癌組織中，周期蛋白E陽性表達率為75.0%(45/60)，其中弱陽性18例、中度陽性15例、強陽性12例；生存素陽性表達率為50.0%(30/60)，其中弱陽性11例、中度陽性10例、強陽性9例；正常結腸組織中，周期蛋白E陽性表達率為3.3%(1/30)，生存素陽性表達0例。結直腸癌組織組中周期蛋白E和生存素的陽性表達率高于正常結直腸組織(χ2=30.077，P<0.001；χ2=16.000，P<0.001)，見圖1、圖2。

圖1 結直腸黏膜組織中周期蛋白E的表達情況(免疫組織化學染色法，×400) 1a為正常結直腸黏膜周期蛋白E陰性表達，1b為結直腸癌黏膜周期蛋白E弱陽性表達，1c為結直腸癌黏膜周期蛋白E中度陽性表達，1d為結直腸癌黏膜周期蛋白E強陽性表達

圖2 結直腸黏膜組織中生存素的表達情況 (免疫組織化學染色法，×400) 2a為正常結直腸黏膜生存素的陰性表達，2b為結直腸癌黏膜生存素弱陽性表達，2c為結直腸癌黏膜生存素中度陽性表達，2d為結直腸癌黏膜生存素強陽性表達

2.2結直腸癌組織中周期蛋白E和生存素蛋白的陽性表達與臨床病理因素的關系 不同性別、組織分化、腫瘤浸潤位置周期蛋白E和生存素陽性表達率比較差異均無統計學意義(P>0.05)；年齡≥50歲者周期蛋白E和生存素陽性表達率均高于年齡<50歲者(P<0.05)；Dukes分期為 Ⅲ～Ⅳ 期者周期蛋白E和生存素陽性表達率均高于Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)；發生淋巴結轉移者周期蛋白E和生存素陽性表達率均高于未發生淋巴結轉移者(P<0.05)，見表1。

表1 結直腸癌中周期蛋白E和生存素蛋白的陽性表達與臨床病理因素的關系 [例(%)]

2.3結直腸癌中周期蛋白E和生存素表達強度與臨床病理因素的相關性 周期蛋白E和生存素陽性表達強度與Dukes分期和淋巴結轉移均呈正相關(P<0.01)，見表2。

表2 結直腸癌中周期蛋白E和生存素的表達強度與臨床病理因素的相關性

3 討 論

腫瘤的形成過程極為復雜，受多因素、多基因間的相互作用影響最終形成惡性腫瘤[10]。生物體在生長發育過程中，維持機體正常細胞的增殖、凋亡，細胞增殖、凋亡失調將對組織細胞生物學行為產生不良影響，進而導致腫瘤的發生[11]。據相關研究顯示，在結直腸癌發生和發展過程中細胞增殖和凋亡均發揮重要作用[12]。

在細胞周期調控過程中，周期蛋白E發揮重要作用，與結直腸癌的發生發展存在密切關系，該蛋白與細胞周期蛋白依賴性激酶2結合，可以促進細胞由G1期向S期轉變，從而使細胞周期正常運轉。通常情況下，周期蛋白E的合成主要處于G1中期，當細胞至S期后，與脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸存在關系的蛋白會發生水解，從而導致周期蛋白E水平急速下降，因此在細胞的G2和M期不存在周期蛋白E表達，在整個細胞周期期間，周期蛋白依賴性激酶2的表達水平保持穩定[13]。腫瘤發生過程中，周期蛋白E在整個細胞周期間表達，從而激活細胞周期中的周期蛋白依賴性激酶2，導致一些已經停止繁殖的細胞不斷增殖，進入細胞周期內，進而導致腫瘤的發生[14]。許曉陽等[15]通過對比原發性結直腸癌、正常結直腸黏膜以及息肉中周期蛋白E的表達情況發現，周期蛋白E的表達水平與腫瘤大小、病理分級以及是否存在淋巴結轉移顯著相關，可以將周期蛋白E作為結直腸癌的判斷指標。本研究結果顯示，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移者周期蛋白E的陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期和未發生淋巴結轉移者。可見，周期蛋白E的過表達對細胞周期的轉化具有促進作用，可參與結直腸癌的發生及發展。

生存素是一種細胞凋亡抑制蛋白，屬于目前研究中最強的一種凋亡抑制因子，其除對細胞凋亡產生抑制作用外，還可以保護血管、促進腫瘤血管的生成以及在腫瘤的浸潤轉移過程中具有調節性作用等。研究表明，生存素在正常的分化組織中不表達，但是在各種腫瘤組織中呈高表達，該性質使其在腫瘤的早期診斷、治療以及預后評價中具有獨特的優勢，同時生存素表達水平升高可抑制細胞的正常凋亡，延長腫瘤細胞生存期，使已經停止增殖的細胞出現異常增殖和惡化，增加結直腸癌的發生率[16]。另有研究顯示，生存素具有多種生物學活性，可通過抑制細胞凋亡、保護血管、調節細胞周期參與結直腸癌的發生發展[17]。楊東杰和姚宏[18]對66例大腸癌組織進行檢測，發現生存素在大腸癌組織中的陽性表達率為71.21%(47/66)，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期及發生淋巴結轉移患者生存素的陽性表達率均為81.58%(31/38)。本研究結果顯示，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期以及發生淋巴結轉移者生存素陽性表達率明顯升高，與上述研究結果類似。提示生存素的高表達對細胞的凋亡產生抑制作用，不僅提高結直腸癌癌細胞的生存能力，還參與結直腸癌的侵襲和轉移，其表達水平可能成為判斷結直腸癌預后的潛在指標。

研究表明，生存素的表達與患者的年齡、性別以及腫瘤的分化程度無相關性，但與患者的Dukes分期和淋巴轉移顯著相關[19-20]。本研究結果顯示，周期蛋白E和生存素表達強度與Dukes分期和淋巴結轉移均呈正相關(P<0.01)，與上述研究結論類似。提示，周期蛋白E、生存素與結直腸癌患者臨床分期和是否發生淋巴結轉移存在一定關系，周期蛋白E的表達可能將結直腸癌細胞進行部分轉化，即從G1期轉化至S期，使DNA合成增加。而生存素則使經DNA合成后的細胞從G2期轉化為M期，周期蛋白E和生存素發揮協同作用，促進結直腸癌的發生、發展，使患者臨床分期、淋巴結轉移等臨床癥狀和體征表現更加明顯[21-23]。

綜上所述，周期蛋白E和生存素在結直腸癌組織中高表達，與患者的Dukes分期、淋巴結轉移密切相關，可成為判斷結直腸癌患者預后的潛在指標。