乳香與醋乳香對2型糖尿病大鼠改善作用的對比研究?

宋志前， 劉振麗， 彭詩濤， 萬曉瑩， 王 淳， 寧張弛

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所， 北京 100700)

近年來，我國糖尿病人數快速增長。據世界衛生組織預測，到2050年我國糖尿病患者數量將居世界首位[1]。糖尿病的致死率和致殘率高[2]，對人類健康造成了重大威脅，開展糖尿病的防治工作至關重要。

乳香為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂具有活血定痛、消腫生肌的功效，是治療血瘀證的要藥之一[3]。中醫認為，糖尿病屬于消渴范疇。據《靈樞·五變》記載：“血脈不行，轉而為熱，熱則消肌膚，故為消癉。”血瘀貫穿于糖尿病發展的整個過程，而乳香是治療血瘀證的重要中藥之一[4-6]。炮制是中醫臨床用藥的特色，中藥必須經過炮制才能供臨床使用[7]。傳統中藥炮制理論認為，乳香經過醋炙后，可增強其活血行氣止痛功效，降低刺激性[8]。而醋乳香對2型糖尿病模型動物是否有作用，以及醋炙前后作用是否存在差異還未見研究報道。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)作為誘導劑，輔以高脂飼料喂養，構建2型糖尿病大鼠模型，在給藥的過程中監測體質量和空腹血糖的變化，通過比較乳香、醋乳香給藥大鼠血液中的胰島素、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, GHb)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、內皮素-1(endothelin-1, ET-1)水平和胰島病理切片，探究乳香醋炙前后對糖尿病大鼠的作用差異。本研究經中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物倫理審查委員會批準，倫理編號2018-066。

1 材料

1.1 動物

采用30只雄性清潔級SD大鼠，體質量(280±10)g，購自中國食品藥品檢定研究所，實驗動物許可證號SYXK(京)2017-0005。飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所SPF級動物房，環境溫度(25±2)℃，相對濕度50%～70%，常規適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 飲片、藥品及試劑

乳香(批號805270216)，購自北京同仁堂藥店，經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.樹皮滲出的樹脂；鹽酸二甲雙胍片(0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370)；STZ(Sigma-Aldrich，貨號101252400)；羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na，上海滬試，貨號20161025)；甲醛(天津福晨，貨號20180420)；一次性使用采血針(蘇州施萊，貨號C0944)；ACCU-CHEK血糖試紙(上海羅氏，貨號06656757)；大鼠胰島素ELISA試劑盒(上海滬峰，貨號20011649R)；糖化血紅蛋白試劑盒(上海滬峰，貨號20011650R)。

1.3 儀器

低溫離心機(型號5418R)Eppendorf；數字式超級恒溫浴槽(型號HSS-1B)上海安亭公司；酶標儀(型號Multiskan MK3)Thermo Fisher；倒置顯微鏡(型號CKX41)Olympus；石蠟包埋機(型號OML-BMA)湖北歐美萊公司，手動旋轉式石蠟切片機(型號SLEE)Labsun。

2 方法

2.1 乳香及醋乳香混懸液的配制

根據前期研究篩選的實驗條件及2020版《中華人民共和國藥典》[3]制備醋乳香。稱取適量乳香采用中火加熱，電磁爐溫度達到130 ℃后投入乳香不斷翻炒，炒制約9 min后觀察到乳香表面微溶、冒煙，按照乳香與米醋10∶1的比例噴入米醋繼續翻炒，約11 min后觀察到表面呈油亮光澤時迅速取出，將炒制好的醋乳香轉移至托盤中攤放晾涼，備用。

取等量的乳香和醋乳香，相同條件下粉碎過100目篩。按照70 kg人體用藥劑量，用0.5%CMC-Na溶液制成濃度為86.4 g/L的乳香和醋乳香混懸液，4 ℃儲存備用。用時室溫放置60 min，振搖使其混勻。

2.2 二甲雙胍混懸液的配制

稱取適量二甲雙胍片粉碎，過100目篩。按照70 kg人體用藥劑量，用0.5%CMC-Na溶液配成濃度為13.5 g/L的二甲雙胍混懸液，4 ℃儲存備用，用時室溫放置60 min，振搖使其混勻。

2.3 STZ溶液配制

避光條件下稱取0.5 g STZ，加入50 mL 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，充分震蕩使其溶解，現用現配。

2.4 誘導大鼠糖尿病模型

大鼠自適應性飼養1周。禁食12 h后，按照50 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ檸檬酸鈉緩沖液，并采用高脂飼料喂養，7 d后取尾尖靜脈血檢測空腹血糖，空腹血糖值大于16.0 mmol/L則為造模成功。

2.5 分組與給藥

除正常組外，將模型動物分為模型組、乳香組(0.90 g/kg)、醋乳香組(0.90 g/kg)、陽性藥組(0.135 g/kg)4組各6只。正常組與模型組給予0.5% CMC-Na溶液，陽性藥組給予鹽酸二甲雙胍混懸液，乳香組和醋乳香組分別給予臨床等效劑量的相應藥物，每天灌胃給藥1次，連續給藥2周。

2.6 取材

末次給藥后禁食8 h，測定各組大鼠空腹血糖。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為0.3 mL/100 g。麻醉后固定于手術臺，打開腹腔暴露腹主動脈，以10 mL注射器收集全血分裝至血清管及EDTA抗凝管中。同時取大鼠胰腺，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，浸入10%中性甲醛緩沖液中固定。

2.7 指標檢測

2.7.1 體質量及空腹血糖檢測 采集大鼠的體質量數據，每周1次，同時取尾尖靜脈血檢測空腹血糖值并記錄。

2.7.2 ELISA法檢測血中胰島素、GHb、NO及ET-1含量 參照ELISA試劑盒說明書方法，分別測定各組大鼠血清中的胰島素、NO、ET-1和EDTA抗凝全血中的GHb水平。

2.7.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosi，HE)染色法觀察胰腺病理切片 10%中性甲醛緩沖液固定24 h后進行常規脫水、透明處理，胰腺組織采用常規石蠟包埋、切片，切片厚度約為5 μm，取石蠟切片，采用HE染色法，在光學顯微鏡下評估胰腺組織病理變化。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠體質量和空腹血糖結果

圖1a示，體質量結果顯示，在造模1周內STZ誘導的模型組大鼠體質量較正常組顯著下降(P<0.01)，在隨后2周的藥物干預作用下，二甲雙胍陽性藥組體質量顯著增加(P<0.01)，乳香和醋乳香組大鼠的體質量較模型組亦顯著增加(P<0.01)，且醋乳香對糖尿病大鼠的體質量增加作用大于乳香(P<0.01)。

注：a.體質量；b. 空腹血糖；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01；與乳香組比較：&&P<0.01圖1 乳香醋炙前后對糖尿病模型大鼠體質量及空腹血糖干預作用比較(n=6)

注：a. 胰島素；b. 糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin, GHb)；c. 一氧化氮(Nitric oxide, NO)；d. 內皮素-1(Endothelin-1, ET-1)；與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01；與乳香組比較:&&P<0.01圖2 乳香醋炙前后對糖尿病模型大鼠血中胰島素、GHb、NO及ET-1的干預作用(n=6)

圖1b示，在造模后1周內，各組STZ造模大鼠空腹血糖值相比于正常組顯著升高(P<0.01)，并逐漸趨于穩定。在隨后2周的藥物干預中，乳香、醋乳香及二甲雙胍均能顯著降低大鼠空腹血糖值(P<0.05或P<0.01)，醋乳香改善血糖的作用優于乳香(P<0.01)，且在第3周的改善作用最佳。

3.2 各組大鼠血中胰島素、GHb、NO及ET-1結果

圖2a示，與正常組比較，模型組大鼠的胰島素水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，乳香組、醋乳香組和二甲雙胍組胰島素水平均顯著提高(P<0.01)，且醋乳香組的升高作用優于乳香組(P<0.01)。

圖2b、圖2c、圖2d示，與正常組比較，模型組大鼠GHb、NO、ET-1水平均顯著提升(P<0.01)；與模型組比較，乳香組、醋乳香組和二甲雙胍組血中GHb、NO、ET-1水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且醋乳香組的降低作用均優于乳香組(P<0.01)。

3.3 各組大鼠胰腺組織病理學觀察結果

圖3示，正常組大鼠胰島分布于腺泡之間呈球形，邊緣整齊，胰泡細胞無變性、壞死等病變。而模型組大鼠細胞數量減少，形態不規則，胰島萎縮。二甲雙胍組大鼠胰腺結構顯著改善，乳香組和醋乳香組較模型組大鼠均有所改善，且醋乳香的干預效果優于乳香。

注：a.正常組； b.模型組；c.乳香組； d.醋乳香組；e.二甲雙胍組圖3 乳香醋炙前后對糖尿病模型大鼠胰腺組織的干預作用(HE×200)

4 討論

目前國外臨床研究顯示，乳香可以有效治療糖尿病，糖尿病患者以250 mg日服用劑量連續服用8周后，其空腹血糖、GHb和甘油三酯均顯著降低[9]。另有報道，以900 mg/d劑量的乳香干預2型糖尿病患者6周后，患者血清中的高密度脂蛋白、膽固醇和果糖胺水平均顯著下降；谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶水平均極顯著降低[10，11]。Azadmehr等[12]通過臨床研究證實，乳香可以顯著降低空腹血糖、胰島素抵抗指數、GHb、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，具有抗氧化、降糖、降脂的功效。現代藥理學研究表明，乳香在降低糖尿病模型大鼠血糖的同時，還能降低炎性因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的分泌[13]。

中醫理論認為，元氣虛衰、氣血津液留滯導致的血瘀是2型糖尿病的病因病機之一[14，15]。現代臨床和實驗研究證實，在糖尿病發生發展過程中，瘀血作為致病因素貫穿始終。祝諶予最先提出糖尿病“瘀血為患”的觀點[16]，并發現臨床大多數糖尿病患者具有舌質紫暗、舌上有瘀點或瘀斑、舌下青紫或見面部瘀斑等血瘀證表現，行活血化瘀法治療后病情有較大改善，故將血瘀列為糖尿病的重要病機[17]。而林蘭認為血瘀是糖尿病的重要病理產物，也是重要的致病因素，影響糖尿病的轉歸和預后[18]。在糖尿病病理狀態下，氣、血、津液運化失調產生的痰、瘀、濁、毒在血脈形成蓄積[19]，臟腑之中玄府運化失調產生“糖毒”與諸邪滋生“濁毒”，日久損傷絡脈，氣虛無力推動血脈中的濁毒，又可導致“流滯”的發生[14]。乳香氣香能香竄調氣，味辛能散瘀活血，性溫能通經絡，內能宣通臟腑氣血，外能透達經絡，可用于一切氣滯血瘀諸證，包括2型糖尿病的防治。

乳香醋炙一直是中醫藥臨床的用藥特色，研究顯示炮制可以增強中藥療效。本研究結果表明，乳香醋炙后可以顯著提升2型糖尿病大鼠的胰島素水平，降低空腹血糖及GHb含量，抑制NO及ET-1水平，可見醋炙確實提升了乳香對2型糖尿病的改善作用。

醋炙對乳香化學成分的影響是改變其藥效作用的基礎，乳香最主要的活性成分是三萜類的乳香酸成分[19-21]，主要包括11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid，KBA)和3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)、β-乳香酸(β-boswellic acid，β-BA)等[22-24]。課題組前期研究結果表明，乳香醋炙前后乳香酸類成分變化明顯，其中AKBA與β-BA的含量大大提升[25，26]，同時還發現具有9,11-去氫結構的乳香酸成分在醋炙后含量增加了10.8倍之多。此外，乳香醋炙過程的炮制輔料醋也同樣對乳香活血作用的改善發揮了積極作用。課題組前期研究發現，醋中含有豐富的具有活血止痛作用的川芎嗪、四氫哈爾滿堿、麥角胺等活性成分，因此輔料醋中的成分也是乳香醋炙后活血止痛作用增強的重要物質基礎[19]。盡管針對乳香及其主要乳香酸成分干預2型糖尿病的機制研究有限，但有報道顯示乳香酸類成分的抗炎機制與糖尿病等慢性炎癥疾病的發生發展密切相關，其可通過系統調控TNF-α誘導基因變化而發揮作用，如基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、基質金屬蛋白酶-10(matrix metalloproteinase-10，MMP-10)和基質金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)[27]。另有研究表明，乳香還可介導磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，抑制血管舒張因子NO和一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的分泌[13]。本研究的實驗結果表明，乳香醋炙后降低NO及ET-1作用更加顯著，可見醋乳香能夠通過調節血管的炎癥環節改善2型糖尿病，但何種成分對2型糖尿病產生確切療效以及其介導血管炎癥的生物學機制還需進一步研究加以論證。