趨化因子CCL18與乳腺癌臨床病理特征的關系及其對乳腺癌細胞EMT過程的影響

劉佩萸 張萬福 李曉剛 楊家娟 方醒藝 李 波

CCL18是由腫瘤相關巨噬細胞分泌的趨化因子，研究表明其與癌癥的不良預后相關[1,2]。上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程[3]。其主要特征有細胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉化為波形蛋白(Vimentin)為主的細胞骨架等[4]。EMT在胚胎發育、組織重建、多種纖維化疾病和癌癥轉移中發揮了重要作用[5,6]。本研究旨在探索趨化因子CCL18與乳腺癌臨床病理特征的關系及其在促進腫瘤發展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年12月，于我院普外科行手術切除治療的乳腺癌患者50例。所有患者均經組織病理學檢查確診為乳腺癌并首次治療，術前未接受放化療及內分泌治療等輔助治療。納入研究的患者年齡35～78歲，平均年齡為(55.5±12.0)歲，TNM分期:Ⅰ期3例，Ⅱ～Ⅲ期28例，Ⅳ期19例。雌激素受體陽性者41例，陰性者9例。各分期患者年齡、性別等基本資料之間無統計學差異(P>0.05)。納入標準:①病理學檢查確定其為乳腺癌;②符合WHO乳腺癌分類標準;③無腫瘤病史者;④獲得患者及其親屬的認同。排除標準:①伴有其他嚴重器質性疾病;②有其他惡性腫瘤并發患者;③已治療患者;④無完整臨床資料者。本研究經我院的倫理委員會審核通過。所有患者均行乳腺癌根治術治療，手術中留取癌組織。

1.2 細胞、試劑與儀器

人乳腺癌細胞株BT-474、MDA-MB-231(中國科學院上海生命科學研究所)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Transwell小室(美國Corning)；Matrigel膠(美國Corning)；q-RT-PCR檢測試劑盒(昆明贊納生物科技有限公司)；兔抗人CCL18多克隆抗體(英國Abcam)；兔抗人E-cadherin和Vimentin多克隆抗體(美國PeproTech)；RM2245半自動輪轉式切片機(德國LeicaBiosystems)實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 乳腺腫瘤組織切片水化后高溫法修復抗原，血清封閉，兔抗人CCL18一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育5 min，DBA顯色，蘇木精復染，脫水封片后鏡下觀察。結果判定：以顯微鏡下棕黃色胞質染色細胞為陽性反應,計數全視野內陽性細胞數。

1.3.2 細胞培養 取液氮保存的細胞，于37 ℃水浴鍋中快速解凍，將細胞接種至含10%胎牛血清的1640培養基中，培養1 h。細胞貼壁后，更換新鮮培養基，繼續培養直到形成單層，即可傳代。

1.3.3 Transwell侵襲實驗 -20 ℃保存的Matrigel膠置于4 ℃過夜融化。用不含血清的培養基稀釋后加入小室中,覆蓋整個聚碳酸酯膜。37 ℃下放置30 min,使Matrigel膠凝固。制備單細胞懸液濃度為2×105個/ml，將200 μl細胞懸液加入Transwell小室上室中，下室加入600 μl含CCL18濃度梯度的完全培養基。培養48 h后取出小室，用棉簽擦去上室內細胞，甲醇固定下室細胞，結晶紫染色后顯微鏡下拍照計數。

1.3.4 Western Blot 收集細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉印，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min×6次，加入二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌5 min×6次，ECL發光液顯影。

1.3.5 q-RT-PCR 收集細胞，加入Trizol按說明書步驟提取總RNA進行逆轉錄。采用20 μl體系進行q-RT-PCR。所用引物序列：SNAIL:F:5'-CATCCTTCTCACTGCCATGGA-3',R:5'-AGGCAGAGGACACAGAACCAGA-3';SLUG:F:5'-CAGCTCAGGAGCATACAG-3',R:5'-GAGGAGGTGTCAGATGGA-3';TWIST:F:5'-GCCGGAGACCTAGATGTCATT-3',R:5'-CCCACGCCCTGTTTCTTTGA-3'。

1.4 統計分析

應用SPSS19.0軟件進行統計分析，組間采用單因素方差分析進行比較，P<0.05認為有統計學差異。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁組織內CCL18的表達及其與臨床病理參數相關性

CCL18在乳腺癌組織中陽性表達率為64.00%，在癌旁組織中不表達，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。且CCL18表達量與乳腺癌患者年齡、絕經情況無關(P>0.05)，與TNM分期有關(P<0.05)。見表2。

表1 CCL18在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(例，%)

2.2 CCL18對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果(圖1)顯示，低濃度和高濃度CCL18均促進了BT-474細胞和MDA-MB-231細胞的侵襲能力(P<0.05)。

圖1 CCL18對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

2.3 CCL18通過激活SNAIL轉錄因子促進乳腺癌細胞發生EMT

CCL18促進BT-474細胞和MDA-MB-231細胞表達Vimentin蛋白，抑制E-cadherin蛋白的表達(P<0.05)，促進乳腺癌細胞發生EMT(圖2)。

圖2 CCL18對乳腺癌細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平的影響

EMT相關轉錄因子中，CCL18激活了SNAIL轉錄因子的表達(P<0.05)，促進BT-474細胞和MDA-MB-231細胞發生EMT(圖3)。

圖3 CCL18對EMT相關轉錄因子激活水平比較

3 討論

乳腺癌是女性發病率最高的癌癥，復發和轉移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因[7]。因此對乳腺癌轉移機制的探索對提高乳腺癌患者的生存至關重要。腫瘤轉移過程主要包括原位侵襲，外滲，循環生存和遠處器官定植等一序列順序事件[8]。EMT對轉移級聯反應初始步驟的發生有著至關重要的作用[9]。腫瘤細胞經過EMT過程，失去上皮細胞連接和極性，獲得間充質細胞表型以及遷徙和侵襲能力，促進腫瘤轉移的發生[10]。

趨化因子是腫瘤微環境中的重要調控因子，在癌癥相關炎癥和進展中起著關鍵作用[11]。多種趨化因子被證實參與腫瘤的發生、發展[12]。如趨化因子CXCL8通過調控腫瘤干細胞的增值和自我更新能力，在腫瘤進展和轉移中發揮著重要作用[13]。CXCL12則被證明在促進腫瘤血管生成過程中扮演著重要角色[14]。除此之外，趨化因子還可以直接促進腫瘤的增值能力和侵襲能力[15-17]。之前的研究表明，乳腺癌組織中的M2型巨噬細胞分泌CCL18[18]。在本研究中，我們發現CCL18在乳腺癌組織中的表達比在癌旁組織中明顯升高，且與腫瘤的TNM分期顯著相關。且Chen等[18]研究發現，CCL18的表達量與反應細胞增殖能力的Ki67的表達量相關性不顯著。因此，我們檢測了CCL18對乳腺癌侵襲轉移能力的影響，發現低水平和高水平的CCL18都能促進乳腺癌細胞的侵襲能力，確定了CCL18通過促進乳腺癌細胞侵襲能力影響腫瘤的發展。之后我們檢測了與腫瘤侵襲能力相關的EMT相關蛋白，發現CCL18促進乳腺癌細胞高表達波形蛋白，而E-鈣黏蛋白表達量下降。由此我們確定趨化因子CCL18通過促進乳腺癌細胞發生EMT促進腫瘤轉移的發生。為了明確CCL18促進乳腺癌細胞發生EMT的途徑，我們檢測了EMT相關的轉錄因子，發現SNAIL轉錄因子高表達。這表明趨化因子CCL18通過激活SNAIL轉錄因子促進乳腺癌細胞發生EMT。

綜上所述，乳腺癌組織中高表達趨化因子CCL18，且與腫瘤TNM分期顯著相關。在乳腺癌中CCL18可能通過激活SNAIL轉錄因子促進乳腺癌細胞發生EMT，增強乳腺癌細胞侵襲能力，最終導致轉移的發生。