基于環境DNA宏條形碼技術的秦淮河生物多樣性研究

王 晨,陶 孟,李愛民,*,施 鵬,楊江華,,王志浩,張效偉,

1 南京大學環境學院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京 210023 2 南京易基諾環保科技有限公司,南京 211100

淡水生態系統雖僅占地球表面的0.8%,但其獨特的生境卻為全球6%的已知物種提供了棲息地[1]。而它所面臨的生物多樣性危機卻不斷加深,據世界自然基金組織(World Wide Fund for Nature,WWF)報道[2],到2014年,淡水脊椎動物的地球生命力指數(Living Planet Index,LPI)已經下降了83%。隨著淡水生態系統生物多樣性不斷喪失[3],生物多樣性保護也受到了廣泛的關注和認可[4—5],而物種資源調研作為生物多樣性保護的基礎,其緊迫性不容小覷。

秦淮河是南京的母親河,但近幾十年來,劇烈的城市化進程嚴重破壞了秦淮河的水生生態系統。目前針對秦淮河生物多樣性的研究較少,已有研究主要集中在秦淮河局部河段的常規水質指標分布[6]、細菌的群落結構[7—8]、單一物種群落結構[9—13]和水資源保護與治理途徑[14]上,缺乏對秦淮河生物多樣性全貌的整體調研。而生物多樣性的調研對調研技術的科學性、全面性均提出了更高的標準,先前零散的調查[10—13]已無法滿足現階段的研究和管理需求。

環境DNA宏條形碼技術是將高通量測序(High throughput sequencing,HTS)技術與生物識別的DNA條形碼相結合,利用HTS獲得條形碼基因擴增子,通過生物信息學手段分析鑒定群落的物種組成[15]。相較于傳統的條形碼,環境DNA宏條形碼因具有更高的擴增速度、精度以及更低的成本而受到了廣泛的關注[16—17]。大量研究表明,環境DNA宏條形碼可用于水生生態系統的生物監測[17—20]。不同的引物對生物類群的偏好不同[15],線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)[21—22]、18S-V9 rDNA[23—24]和12S rRNA[25—26]分別廣泛用于大型無脊椎動物、真核生物和脊椎動物多樣性研究。國內環境DNA宏條形碼在淡水生態系統中的應用雖有報道,但主要集中在個別種群[27—28],全面的生物多樣性監測在國內報道較為罕見。

本研究以秦淮河為研究區域,利用環境DNA宏條形碼評估秦淮河淡水生態系統中生物多樣性,探究(1)秦淮河生物多樣性的組成；(2)上下游生物多樣性的差異；(3)生物多樣性與環境因子的關系,以期為秦淮河的生物多樣性保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點位及環境DNA樣本采集

秦淮河位于長江下游,共有南北兩源,北源句容河發源于句容市寶華山南麓,南源溧水河發源于南京市溧水區東廬山。于2019年7月,在秦淮河主干共設置32個采樣點,具體采樣點位信息見圖1、表1。每個采樣點位采集3L表層水樣,采集后在24h內,每個點位300mL水樣使用0.22μm無菌濾膜(廣東環凱微生物科技有限公司)真空抽濾得到濾膜(各點位5—7個平行),濾膜保存至-80℃冰箱中,直至DNA提取。

圖1 秦淮河采樣點位圖Fig.1 Sampling sites in Nanjing city of Qinhuai River圖中數字表示采樣點位序號

表1 秦淮河點位分組

1.2 環境因子的測定

采用便攜式水質參數儀(HACH SL1000)現場測定pH值和溶解氧(DO)；采集后的水樣運回實驗室后在24h內測定完其理化指標。氨氮(NH3-N)、總磷(TP)和總氮(TN)使用國家標準方法測定；亞硝酸鹽氮(NO2-N)和硝酸鹽氮(NO3-N)過0.45μm的水膜后使用離子色譜(Thermo Fisher ICS5000+)測定；總有機碳(TOC)使用TOC儀(耶拿 multi N/C 3100)測定；化學需氧量(COD)使用哈希COD儀(DR 2800)測定。

1.3 DNA提取及PCR擴增

使用MO BIO PowerSoil?DNA分離試劑盒(QIAGEN)提取DNA。提取完成后,使用NanoDrop測定DNA的濃度及質量。針對不同生物類群選擇不同的PCR引物進行測試,詳見表2。12S引物PCR擴增總體系50 μL,包含2×Taq Plus Master Mix Ⅱ 25 μL(諾唯贊),上下游引物各2 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL,擴增片段長度170 bp；擴增條件：95℃預變性3 min,95℃變性15 s,62.4℃退火20 s,72℃延伸20 s,30個循環。18S-V9引物PCR擴增總體系50 μL,包含2×Phanta Max Master Mix 25 μL(諾唯贊),上下游引物各2 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL,擴增片段長度130 bp；擴增條件：95℃預變性3 min,95℃變性20 s,59℃退火20 s,72℃延伸15 s,25個循環。COI引物反應體系與18S-V9引物一致,擴增片段長度310 bp；反應條件：95℃預變性2 min,95℃變性15 s,46℃退火30 s,72℃延伸40 s,35個循環。PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,瓊脂糖凝膠濃度為2%,核酸染料采用GelRed,電泳電壓110V,電泳時間30min,使用100bp DNA Ladder對產物DNA鏈長度進行大致劃分。電泳完成后,使用ImageLab判斷電泳是否成功,要求PCR擴增產物有目的條帶,且條帶清晰單一,陰性對照無顯著條帶。最后使用磁珠法對PCR產物進行純化處理,并利用Qubit測定純化產物濃度,純化產物DNA濃度要求大于2.5 ng/μL。

表2 DNA提取引物信息

1.4 高通量測序

委托南京易基諾環保科技有限公司進行測序。使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent (E6270)試劑盒進行測序文庫的構建。利用凝膠電泳對所構建的文庫質量進行檢查,并使用Qubit進行文庫濃度定量。最后選用Chip 530芯片在Ion Torrent S5平臺進行二代測序。

1.5 生物信息學數據數據分析

根據UPARSE將序列以97%的相似性(18S和COI)和99%(12S)聚類到可操作的分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs)。對于18S和COI的OTU使用核糖體數據庫(Ribosomal Database Project,RDP)進行分類并在Greengenes[29]和SILVA[30]數據庫中進行注釋；12S OTU代表序列在NCBI中的核苷酸數據庫GenBank中進行注釋[31]。將分屬同一類群的OTU組合,以估計該類群的豐度。Shannon-Weiner指數、主坐標分析、PERMANOVA檢驗及相似性距離關系等統計分析均使用R軟件(3.5.3)中的vagan包,可視化繪圖使用R軟件中ggplot2包及Origin 2020b。

2 結果與分析

2.1 秦淮河環境DNA物種注釋

秦淮河32個采樣點位環境DNA宏條形碼測試結果及物種注釋結果如表3所示。

表3 秦淮河環境DNA宏條形碼測試結果

2.2 秦淮河物種分布

2.2.1秦淮河浮游動物(目水平)分布

綜合32個點位浮游動物目水平注釋結果,秦淮河游泳輪蟲目(Ploima)、雙甲目(Diplostraca)和未歸類的浮游動物(unassignedzooplankton)的序列數占比較高,分別占比31.95%、31.42%和27.40%。但是不同點位優勢種占比差異較大,點位9中雙甲目(Diplostraca)占比高達95.91%,點位15中游泳輪蟲目(Ploima)占比高達75.08%,點位27和28中未歸類的浮游動物(unassignedzooplankton)占比較高。

2.2.2秦淮河浮游植物(門水平)分布

秦淮河中浮游植物的優勢種群為隱藻門(Cryptomonas)、褐藻門(Ochrophyta)及綠藻門(Chlorophyta),其序列數占比分別為46.35%、41.76%和5.85%,占序列總數的93.96%。點位15隱藻(Cryptomonas)占比最高,為72.53%；點位23褐藻(Ochrophyta)占比最高,為86.42%。上游北支(點位15—23)呈現出,從上游到下游,隱藻占比逐漸下降而褐藻占比逐漸上升的趨勢；下游(點位1—13)除點位6外和上游南支(點位14、點位24—32),隱藻和褐藻占比變化不大。

2.2.3秦淮河底棲動物(門水平)分布

秦淮河中底棲動物序列數占比較高的種群為節肢動物門(Arthropoda)和刺胞動物門(Cnidaria),其占比分別為91.67%和7.13%,占總序列的98.8%。雖然軟體動物門(Mollusca)在總序列中占比較低,但在點位23中占比達45.75%。相較于浮游動物而言,底棲動物測得的總序列數較少,僅占COⅠ引物測序總數的17.78%。

2.2.4秦淮河魚類(目水平)分布

魚類屬于輻鰭魚綱,共檢出14目。其中鯉形目(Cypriniformes)、蝦虎魚目(Gobiiformes)和鯡形目(Clupeiformes)為優勢種群,占比分別為69.99%、15.86%和5.42%。鯉形目(Cypriniformes)在32個點位中占比均最高,占比區間為51.81%—81.34%。除個別點位(點位10、點位24和點位25)外,秦淮河魚類分布占比較為平均。

圖2 秦淮河浮游動物目水平占比Fig.2 Proportion of zooplankton classified in Order level in Qinhuai River

圖3 秦淮河浮游植物門水平占比Fig.3 Proportion of phytoplankton classified in Phylum level in Qinhuai River

圖4 秦淮河底棲動物門水平占比Fig.4 Proportion of zoobenthos classified in Phylum level in Qinhuai River

圖5 秦淮河魚類目水平占比Fig.5 Proportion of fish classified in Order level in Qinhuai River

2.3 秦淮河生物多樣性

Shannon-Weiner指數常用來評價群落生境內的α多樣性。秦淮河的生物多樣性狀況如圖6所示。秦淮河浮游動物Shannon-Weiner指數均值在1.22—4.03之間,點位9浮游動物多樣性狀況較差,上游浮游動物多樣性比下游更豐富；浮游植物Shannon-Weiner指數均值范圍為3.64—6.48,上游南支浮游植物多樣性均比較豐富,上游北支和下游均呈現多樣性從上游到下游逐漸降低的趨勢；底棲動物Shannon-Weiner指數均值為1.23—3.26,整體Shannon-Weiner指數偏低,點位31、32和下游底棲動物多樣性更貧乏；秦淮河魚類多樣性豐富,Shannon-Weiner指數均值為5.22—6.36。

2.4 秦淮河上下游差異

從Shannon-Weiner指數來看,如圖7所示秦淮河上下游各群落α多樣性相差較小,為了能更直觀地比較各個種群上下游間的差異,本研究對數據進行了降維,并利用PERMANOVA對組間差異從統計學上進行檢驗。

降維使用了主坐標分析,從可視化結果上看,除魚類外,秦淮河上下游物種均有顯著差異。浮游動物的PCoA圖PCo1和PCo2共解釋40.65%的差異,其中下游和上游北支均與上游南支差異顯著；浮游植物的兩個主坐標共解釋41.99%的差異,結果與浮游動物類似；底棲動物的兩個主坐標共解釋35.24%的差異,上游南北支差異顯著；魚類的兩個主坐標共解釋24.615%的差異,但PCoA圖上各組并沒有顯著分開。因此對數據進行PERMANOVA檢驗,從統計學判斷各組間是否有顯著的差異。

圖6 秦淮河生物多樣性Fig.6 Alpha(α) diversity in Qinhuai River

圖7 秦淮河上下游生物多樣性Fig.7 Alpha(α) diversity in the upstream and downstream of Qinhuai River

圖8 秦淮河主坐標分析Fig.8 Principal coordinates analysis of species in Qinhuai River

由PERMANOVA檢驗可知,四類種群上下游各組間均有極顯著差異(P<0.001),主坐標分析圖重合較多分組的可解釋部分(R2)較小,上下游各組間魚類群落雖然有顯著差異,但是R2僅為3.48%,表明上下游位置因素貢獻顯著但占比較小。上下游位置因素對浮游動物和浮游植物和底棲動物群落差異的貢獻較大,R2分別為11.34%、17.52%和9.44%。秦淮河上游不同來源的兩支間群落結構也有顯著差異。

表4 秦淮河組間差異(PERMANOVA)

2.5 秦淮河物種距離衰減變化

圖9 秦淮河物種距離衰減變化Fig.9 Distance-decay relationship of community in Qinhuai River

秦淮河不同物種的距離衰減變化(Distance decay relationship,DDR)趨勢不一致。浮游動物、浮游植物和底棲動物都表現出了顯著的生物相似性隨距離增長而衰減的趨勢(P<0.001),其中底棲動物的衰減趨勢更強。魚類沒有表現出明顯的距離衰減趨勢,詳見圖9。

2.6 秦淮河物種群落與化學指標關系

為了評價秦淮河物種群落與環境因子(TN、TOC、NO2-N、NO3-N、TP、NH3-N、COD、和DO)之間的關系,對其進行了冗余分析,經過膨脹因子檢驗,去除了共線性顯著的NO2-N和NO3-N。其結果如圖10所示。置換檢驗結果表明所選的環境因子(TN、TOC、TP、NH3-N、COD和DO)均對浮游生物和底棲動物群落有極顯著的影響(P<0.001)；對魚類群落結構而言,具有極顯著影響的是DO、TOC、TN,其次是COD和TP,NH3-N對其影響不顯著。

就環境因子影響大小而言,浮游動物的環境因子影響大小排序為：TN>TOC>TP>NH3-N>DO>COD；浮游植物的環境因子影響大小排序為：TOC>TN>DO>TP>COD>NH3-N；底棲動物的環境因子影響大小排序為：TOC>COD>TN>TP>NH3-N>DO；魚類的環境因子影響大小排序為：TOC>DO>TN>COD>TP。

圖10 秦淮河物種群落與環境因子的冗余分析Fig.10 Redundancy analysis ordination plot of OTUs of Qinhuai River constrained by environmental variables

3 討論

3.1 秦淮河物種組成及水質狀況

調研期間,秦淮河32個采樣點位環境DNA宏條形碼技術鑒定到：浮游動物13屬22種407個OTUs；浮游植物85屬60種4445個OTUs；底棲動物16屬17種212個OTUs；魚類53屬44種1663個OTUs。其中浮游動物以游泳輪蟲目(Ploima)和雙甲目(Diplostraca)為主,共占比63.37%；浮游植物以隱藻門(Cryptomonas)和褐藻門(Ochrophyta)為主,共占比88.11%；底棲動物中節肢動物門(Arthropoda)占比最高,達91.67%；魚類中鯉形目(Cypriniformes)占比最高,達69.99%。

石曉丹等[13]2005年在秦淮河流域通過常規形態學鑒定共檢出浮游動物13種,以輪蟲為主,輪蟲占全部種類的69.2%,本次調研中,雖輪蟲占比不及2005年,但也為秦淮河浮游動物中的優勢種。石曉丹等[13]于2005年調研秦淮河的浮游植物,調研表明共檢出43種,以硅藻門和綠藻門為主；嚴瑩[10]于秋冬季對秦淮河的調研共檢出浮游植物37種,以藍藻和硅藻為主。本次調研中浮游植物的檢出結果與以往的文獻報道有較大差異,一方面是由于時間的變化,調研時間跨度較久,浮游植物的變化較大,另一方面由于檢測方式有差異,今后將進一步探究秦淮河浮游植物的時間變化差異。吳東浩等[12]于2009年4月對秦淮河上游底棲動物進行調查,共獲得63個底棲動物分類單元。其中節肢動物門占比最高,達47.6%,這與本次調研有相似的結論,但本次調研中節肢動物門占比更高。秦淮河魚類資源調研資料暫缺,但毛志剛等[32]于2009—2010年對太湖魚類資源進行了調研,共捕獲魚類40屬50種,其中鯉形目占比最高,為總數的68%。徐念等[28]于2016年1月利用環境DNA宏條形碼技術對長江中下游物種進行監測,結果也表明鯉形目在魚類中占比高達60%。本次調研與文獻報道中的長江、太湖流域魚類監測結果類似,這也與長江魚類資源鯉科魚類種類多[33]的特點相吻合。

國內外大量學者研究表明環境DNA宏條形碼技術在物種多樣性調研方面較傳統形態學監測具有顯著優勢,其具有節省時間、人力成本,不需要專業的形態學鑒定人員等優點[16—17]。且其鑒定結果中的物種豐度較傳統形態學監測更高[34—35]。本次調研雖未利用形態學監測進行對比,但與歷史文獻等相對比,結論具有一定的相似性,同時也為秦淮河整體的類群調研提供了新的思路與方法。

根據Shannon-Weiner指數分級評價標準(表5)[36],秦淮河浮游動物,1個點位多樣性“一般”,水體呈現中污染狀態,占比3.12%；9個點位多樣性“較豐富”,水體呈現輕度污染,占比28.13%；22個點位處于“豐富”,水體清潔,占比68.75%。秦淮河所有點位的浮游植物多樣性均為“豐富”。底棲動物中,8個點位多樣性“一般”,占比25%；19個點位多樣性“較豐富”,占比59.38%；5個點位多樣性“豐富”,占比15.62%。秦淮河魚類Shannon-Weiner指數均大于5,均屬于“豐富”級別。總的來說,多樣性指數較低的點位多處于下游和上游南支,下游處于城市住宅中心,屬于居民密集區,受人為活動影響較大,可能因此多樣性較低,水體污染較重；秦淮河上游兩支,總體上游南支(南京)α多樣性較上游北支(句容)更豐富。

表5 Shannon-Wiener指數(H′)分級評價標準

3.2 秦淮河生物多樣性空間差異

本次調研結果表明浮游動物和浮游植物各點位占比差異較大,整體空間變化趨勢相似,可能是由于部分浮游動物以浮游植物為食[37]；底棲動物上游北支與下游近江(長江)點位豐富度更高；魚類群落種類整體分布更為均勻,鯉形目在各點位均為優勢種。空間分布上,主坐標分析和PERMANOVA組間差異檢驗表明秦淮河下游、上游南支和上游北支間有極顯著差異(P<0.001)。其中浮游動物、浮游植物和底棲動物受分組影響更大,R2分別為0.113、0.175和0.094,分組對魚類的影響相對較小,R2僅為0.035。除魚類外,整體上游南支多樣性指數(Shannon-Weiner指數)更高,物種更為豐富,表明秦淮河上游南支(南京)水質狀況更好。距離衰減關系常用來評估物種對地理或環境距離的響應程度。由于不同生物對同一景觀的敏感度不同,因此不同物種的距離衰減關系不同。秦淮河的四個類群中,除魚類外,其余三個類群均表現出了明顯的隨距離增加而衰減的趨勢。浮游動物、浮游植物和底棲動物顯著的距離衰減趨勢表明擴散可能導致它們的組成變化[38]。魚類沒有表現出明顯的距離衰減趨勢可能是由于魚類遷徙能力強,分布廣泛[31],這也與魚類α多樣性指數較為均勻一致。秦淮河生物群落結構和分布的探究,有助于今后制定秦淮河生物多樣性監測的采樣方案；探究地理距離對其群落結構的影響便于今后更好地確定秦淮河生物多樣性保護的重點。

3.3 環境因子對秦淮河生物群落分布的影響

生物群落分布受環境因素的綜合影響,不同水體中環境因素對群落結構的影響也存在差異。相關研究表明,氮、磷等營養鹽能調節浮游植物生長[39],而浮游植物作為生產者是生態系統中消費者食物來源之一,從而也會對其他生物造成影響。Zhou等[40]發現水溫、TP、TN、COD和TOC是影響太湖中浮游動物的主要環境因子；任輝等[41]通過冗余分析發現葉綠素a、溶解氧、鹽度、水溫、TN和pH對珠江河南沙河浮游植物群落結構影響最為密切；陳麗等[42]通過典范對應分析發現拉薩河底棲動物群落結構的主要影響因子為海拔、COD、硫化物、pH、TP和TN。本次調研結果表明,環境因子對秦淮河生物具有顯著的影響,其中DO、COD、TOC以及氮磷營養鹽對浮游生物和底棲動物均有極顯著影響(P<0.001),結論與上述結論類似。本次調研中發現秦淮河魚類群落分布主要受TOC、DO、TN、COD和TP影響,這與李艷利等[43]在河段尺度上對渾太河魚類群落分布的影響環境因子探究結果類似。

冗余分析結果還進一步表明,不同營養級的生物對環境因子的敏感程度有差異。較低營養級的生物對環境因子的變化更為敏感,比如NH3-N對浮游生物和底棲動物均有顯著的影響,但對魚類的影響并不顯著。

4 結論

(1)基于環境DNA宏條形碼技術,秦淮河共監測到浮游動物22種407個OTUs,浮游植物60種4445個OTUs,底棲動物17種212個OTUs,魚類44種1663個OTUs。其中浮游動物以游泳輪蟲目和雙甲目為主,浮游植物以隱藻門和褐藻門為主,底棲動物中節肢動物門占比最高,魚類中鯉形目占比最高。環境DNA宏條形碼技術在物種豐度鑒定方面較傳統形態學監測更具優勢。

(2)通過主坐標分析和PERMANOVA檢驗,發現秦淮河下游、上游南支和上游北支間有極顯著差異(P<0.001)。下游α多樣性較上游更為貧乏,上游南支(南京)α多樣性較上游北支(句容)更豐富。四個類群中,除魚類外,均表現出了明顯的隨距離增加而衰減的趨勢。

(3)冗余分析表明,較低營養級的生物對環境因子的變化更為敏感,浮游生物和底棲動物的主要影響因子為TN、TOC、TP、NH3-N、COD和DO。魚類的影響因子為DO、TOC、TN、TP和COD。

(4)基于環境DNA宏條形碼技術對秦淮河生物多樣性的刻畫,可為秦淮河生物多樣性的保護提供理論參考。