脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物對Raw264.7細胞的聯合毒性效應研究

董燕婕 范麗霞 苑學霞 邵陽陽 王 磊 趙善倉

(山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/山東省食品質量與安全檢測技術重點實驗室, 山東 濟南 250100)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是目前世界上分布最廣泛、影響較大的真菌毒素之一。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇屬B族單端孢霉烯族化合物，俗稱嘔吐毒素，主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)侵染小麥、大麥、玉米等糧食作物產生[1-2]。DON可引起頭暈、嘔吐、腹瀉等癥狀，長期攝入會破壞免疫系統；DON還具有很強的細胞毒性，可抑制蛋白質的合成，造成DNA損傷[3-4]。DON經植物或微生物代謝轉化后可形成隱蔽型毒素(mask mycotoxin)[1,5]，包括乙酰化衍生物,如3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3a-DON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15a-DON)等。在某些情況下，農產品或食品中隱蔽型毒素的含量可能超過原型的含量水平，而且一些隱蔽型毒素會在體內代謝過程中重新轉化為DON，對人類和動物健康造成潛在風險。聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)/世界衛生組織(World Health Organization, WHO)食品添加劑聯合專家委員會(Joint FAO/WHO ExperTCommittee on Food Additives，JECFA)認為DON乙酰化衍生物的毒性與DON相當[6]。因此，JECFA將DON的每日耐受量(permissible tolerable daily intake, PMTDI)(1 μg·kg-1BW)更改為DON及其乙酰化衍生物的PMTDI(1 μg·kg-1BW)。 我國也規定食品及飼料中DON、3a-DON和15a-DON的總量不得超過1 mg·kg-1[7]。研究表明，DON與其衍生型3a-DON、15a-DON共存于小麥、大麥、玉米等糧食作物及其副產品中[8-10]。因此，3a-DON和15a-DON的毒性和污染程度均需要重視。

目前已有大量關于DON毒性及其作用機理的研究報道，但針對DON以及其乙酰化衍生物的聯合毒性及其機理尚鮮見報道。不同毒素間的相互作用會直接影響其混合物對生物體毒性的強弱，從而產生不同的毒性作用反應。研究表明，Raw264.7細胞與機體免疫功能相關，是評價DON暴露毒性的較為敏感的細胞模型；同時，DON具有抑制蛋白質合成，調節細胞因子和趨化因子基因表達的能力[11]。因此，本研究以Raw264.7細胞為體外試驗模型，探究DON、3a-DON、15a-DON的二元和三元混合對細胞存活率、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和凋亡率的影響，采用復合指數法(combination index, CI)探討二元、三元的聯合作用效應，以期為多種毒素混合污染的提供一定的借鑒與參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細胞Raw264.7，購自中國科學院上海細胞研究所；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)高糖培養基、胎牛血清、胰酶、無酚紅HBSS，購自美國Gibco公司；DON、3a-DON和15a-DON標準品(純度≥98%)購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorofluorescent yellow diacetate,DCFH-DA)試劑盒、羅丹明123購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 主要儀器與設備

CCL-170B-8 CO2培養箱，藝斯高(上海)貿易有限公司；Synergy HTX多功能微孔板酶標儀，美國BioTek公司；VD-650-U超凈工作臺，美國Airtech公司。

1.3 細胞培養與染毒

Raw264.7細胞培養于DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、1.0%青霉素-鏈霉素)中，于37℃、5% CO2培養箱中培育至對數生長期。用超純水溶解DON、3a-DON和15a-DON制成母液，使用前再用DMEM培養基稀釋至所需濃度的工作液。

1.4 細胞毒性測定方法

1.4.1 細胞存活率的測定 采用CCK-8法分別測定毒素單獨或混合處理對Raw264.7細胞活性的影響[12]，調整對數期細胞密度為3×104個·mL-1，每孔接種200 μL于96孔板中孵育24 h后，棄去培養液，加入含不同濃度DON、3a-DON、15a-DON的培養液繼續培養24 h，控制DON、3a-DON、15a-DON終濃度分別為0.090、0.180、0.375、0.750、1.500、3.000 μg·mL-1。 每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續在96孔板中孵育2 h，用酶標儀測定其在450 nm波長處的吸光度值。

根據細胞存活率試驗結果確定單獨染毒的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，再根據IC50篩選出合適的DON、3a-DON、15a-DON單獨染毒及其聯合染毒的濃度。

1.4.2 細胞活性氧含量的測定 用氧化敏感熒光探針DCFH-DA(Beyotime)測定ROS的產生[13]。調整對數期細胞密度為5×105個/孔，接種于6孔板中，隨后用DON、3a-DON、15a-DON(0、0.18、1.50、3.00 μg·mL-1)單獨和聯合處理48 h。用無血清培養基沖洗細胞，在10 μmol·L-1DCFH-DA中37℃孵育30 min。然后收集細胞用酶標儀檢測細胞內二氯熒光黃(disperse fluorescent yellow，DCF)的熒光值(激發波長488 nm，發射波長521 nm)。

1.4.3 細胞線粒體膜透性的測定 調整對數期細胞密度為1×104個/孔，接種于96孔板，用DMEM培養基培養24 h，棄去培養基，每孔加入5 μg·mL-1羅丹明123工作液，孵育30 min后，1 000 r·min-1離心10 min，用培養基洗一遍，1 000 r·min-1離心10 min后加入各濃度組的毒素作用24 h，測定熒光值，最后根據標準曲線計算加藥組細胞內檢測到的羅丹明123含量，判斷細胞內線粒體通透性的變化[13]。

1.5 統計與分析

各種毒素的IC50值采用Graphpad Prism 6.01計算，DON、3a-DON和15a-DON間的相互作用類型采用Chou-Talaly數學模型分析獲得。混合物的聯合毒性類型由CompuSyn(Chou and Martin, 2005, Compusyn Inc, USA)[14]軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 DON、3a-DON和15a-DON單獨和聯合對Raw264.7細胞存活率的影響

圖1 DON、3a-DON和15a-DON單獨對Raw264.7存活率的影響Fig.1 Individual effect of DON, 3a-DON and 15a-DON on viability of Raw264.7 cell

在暴露24、48、72 h時，DON、3a-DON和15a-DON對Raw264.7細胞的毒性作用均呈現劑量依賴關系(圖1)。暴露24 h后，DON組細胞存活率由100%下降至9.94%，3a-DON組存活率由100%下降至24.11%，15a-DON組由100%下降到10.97%。根據濃度抑制率曲線可得DON、3a-DON、15a-DON作用細胞24、48、72 h后的IC50值(表1)。DON、3a-DON、15a-DON分別作用Raw264.7細胞24 h時，IC50依次為15a-DON(0.267 μg·mL-1)>DON(0.275 μg·mL-1)>3a-DON(1.806 μg·mL-1)；作用48和72 h時，不同毒素毒性作用差異與24 h類似，且IC50值隨著培育時間的延長而降低，呈現時間依賴效應。因此，對Raw264.7細胞的毒性效應大小依次為15a-DON≈DON>3a-DON。基于CI指數法，CI>1表示拮抗作用；CI=1表示加和作用；CI<1表示協同作用。由此判斷，DON、3a-DON、15a-DON二元或三元聯合后的毒性效應發現，二元或三元聯合后對Raw264.7細胞存活率的影響均高于單一毒素(表2)，相比于單一毒素組IC50的毒素劑量，二元或三元聯合作用在本試驗濃度設置疊加范圍內，表現出一定的協同作用。

表1 DON、3a-DON和15a-DON對 Raw264.7的IC50值Table 1 Individual IC determinations of DON, 3a-DON and 15a-DON in Raw264.7 /(μg·mL-1)

表2 DON、3a-DON和15a-DON二元、三元混合對 Raw264.7的IC50和CI值Table 2 Binary and ternary combined IC50 determinations and CI values of DON, 3a-DON and 15a-DON in Raw264.7

2.2 DON、3a-DON和15a-DON單獨和聯合對Raw264.7細胞活性氧的影響

由圖2可知，ROS濃度均隨著其毒素濃度的增加而增加，存在劑量依賴性。除0.18 μg·mL-1低濃度組外，各毒素刺激作用組的ROS濃度顯著高于對照組(P<0.05)。DON和15a-DON單獨作用對細胞ROS濃度的影響差異不顯著，但顯著高于3a-DON處理組(P<0.05)。DON、3a-DON和15a-DON誘導細胞產生ROS的趨勢基本一致。DON、3a-DON和15a-DON二元或三元聯合的ROS濃度均分別大于相應的單獨作用組，說明多毒素同時存在時毒性作用增強。

注：不同小寫字母表示同處理組不同濃度間在0.05水平差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters aTThe top of the same treatment in differenTConcentration of mycotoxin indicated significant difference at 0.05 level . The same as following.圖2 DON、3a-DON和15a-DON單獨(A)和聯合(B)對Raw264.7活性氧的影響Fig.2 Individual (A) and combined (B) effects of DON, 3a-DON and 15a-DON on ROS content of Raw264.7 cell

2.3 DON、3a-DON和15a-DON單獨和聯合對Raw264.7細胞線粒體膜透性的影響

圖3反映了不同濃度的DON、3a-DON和15a-DON單獨以及聯合處理Raw264.7細胞24 h后線粒體膜透性的變化。與對照組相比，毒素處理組細胞線粒體膜透性增加，且隨著毒素濃度的增加而不斷增加，呈現出劑量依賴性(圖3-A)。引發細胞內線粒體膜通透性轉化的趨勢為15a-DON>DON>3a-DON。DON、3a-DON和15a-DON二元、三元聯合作用Raw264.7細胞24 h后(圖3-B)，細胞內線粒體膜透性轉化組間差異不顯著(P>0.05)，但都大于相對應的單獨染毒組。

圖3 真菌毒素DON DON、3a-DON和15a-DON對Raw264.7細胞線粒體膜通透性的影響Fig.3 Individual (A) and combined (B) effects of DON, 3a-DON and 15a-DON on Raw264.7 cell

3 討論

本研究探究了DON、3a-DON、15a-DON三種毒素單獨和聯合對Raw264.7細胞的毒性作用。結果表明，DON、3a-DON、15a-DON單獨或聯合作用均呈劑量、時間依賴關系，除低濃度外，均顯著降低了細胞活性。采用IC50值比較這3種毒素的毒性強弱，表現為15a-DON≈DON>3a-DON。DON、15a-DON和3a-DON對不同細胞模型的作用均呈現出劑量和時間關系，但IC50值略有不同。Juan-Garcia等[15]研究發現3a-DON和15a-DON作用于人肝癌細胞系HepG2時，毒性效應為15a-DON>3a-DON。Pinton等[16]研究發現DON及其乙酰化衍生物對豬腸上皮細胞的毒性大小為15a-DON>DON>3a-DON。Yang等[17]評估了脫氧雪腐鐮刀菌醇家族真菌毒素DON、3a-DON、15a-DON對人胃上皮細胞GES-1細胞存活率的影響，結果表明單一毒素對細胞的毒性作用為3a-DON<15a-DON

本研究發現，DON、15a-DON和3a-DON二元或三元聯合后在設置的濃度范圍內均呈現一定的協同作用。而Yang等[18]研究表明，DON+15a-DON僅在低和/或中度抑制濃度水平(IC10-IC70，IC10-IC80和IC10-IC40)對GES-1細胞表現為協同細胞毒性，在高濃度下呈現拮抗作用；Alassane-Kpembi等[19]研究表明，DON+15a-DON和15a-DON+3a-DON共同處理IPEC-1細胞時呈協同效應，DON+3a-DON在高濃度時呈協同效應。這可能是由于不同物種的細胞對不同毒素的代謝和受體/通路存在差異。

當細胞內ROS濃度超過其抗氧化能力時，易產生氧化應激反應[20]。DON、15a-DON和3a-DON單一或組合作用后均提高了細胞活性氧濃度和細胞線粒體膜通透性[21]，這與本研究結果相似。研究表明，在多種體外模型試驗中氧化應激在DON誘導的毒性中起主要作用[22-25]。這可能是由于毒素刺激引發ROS的大量產生，細胞發生氧化損傷，從而導致細胞凋亡，線粒體膜完整性被損壞，使得線粒體膜通透性增加[26]。該結果再一次印證了DON誘導的毒性作用可能是由ROS和線粒體應激反應信號共同作用、相互影響的結果[27-28]。

4 結論

本研究表明，DON及其乙酰化衍生物均降低了Raw264.7細胞的活性，提高了細胞內活性氧的含量和細胞膜的通透性，且DON和15a-DON的毒性相當，均高于3a-DON。DON及其衍生物二元、三元聯合后呈協同作用，毒性顯著增強，因此在評價DON與其乙酰化衍生物混合污染的風險時需考慮其協同效應。但是目前DON及其乙酰化衍生物聯合作用的毒性機制尚不清楚，仍需進一步探究其作用靶點和信號通路，為評估DON及其乙酰化衍生物的多殘留聯合毒性機制和制定限量標準提供科學依據。