葡萄酒發酵前后穩定同位素特征變化及初步相關性分析

申 雪 聶 晶 李春霖 邵圣枝 黃 翠 張永志 武 運，* 袁玉偉，*

(1 新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2 浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，浙江 杭州 310021；3 農業農村部農產品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021)

近年來，隨著我國農業結構的發展和工業化進程的加快，葡萄酒的產量有了大幅度增長，消費者對葡萄酒的品質越發重視。葡萄酒是葡萄全果經酒精發酵后的產物[1-2]，不同地域釀酒葡萄品質及葡萄酒釀造工藝差異使葡萄酒具有明顯的地域特色。近年來葡萄酒摻假、地理產地誤標等情況時常發生，對葡萄酒品牌形象和消費者權益造成了嚴重損害[3]。因此，需要開發一種能夠快速、穩健地對原產地進行驗證的方法，以確保能準確識別原產地[4-5]。

穩定同位素比值能反映農產品所處的環境條件并提供可靠、準確的產地來源信息[6]。葡萄酒中穩定同位素組成受原料種植地的光照氣候、地理位置與種植方式的影響，因此不同種植環境中的葡萄酒所含穩定同位素比值表現出一定的地域特征[7-8]，可利用這種地域特征對葡萄酒進行產地判別驗證。近年來，利用該技術探討發酵對穩定同位素的影響取得了良好的成效。Zyakun等[9]系統調查了不同產區中葡萄酒發酵前后δ13C值的變化，發現葡萄酒中δ13C差異是由于釀酒葡萄生長條件和品種所致。Fauhl等[10]對不同發酵條件下的葡萄酒進行了研究，發現酵母菌株、發酵溫度或葡萄酒澄清度等參數對乙醇中甲基位(D/H)Ⅰ均未有顯著影響。Perini等[11]通過研究5個不同發酵階段的126個樣品中的穩定同位素組成，發現發酵階段各指標參數與δ18O無關。綜上，國內外對葡萄酒發酵過程中穩定同位素比值的研究大多集中于單一穩定同位素比值，而對整個發酵過程中各樣品穩定同位素比值的研究較少，無法體現發酵過程中各穩定同位素比值的變化。

本試驗采用元素分析儀-穩定同位素比率質譜(elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS)測定了發酵前(全果、果汁和皮籽)與發酵后(酒和皮渣)各固體樣品中同位素比值的特征差異及相關性，以期為葡萄酒產品的真實性研究提供理論參考與數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗樣品于2020年9月采自新疆焉耆盆地的芳香莊園與鄉都酒莊的葡萄種植基地(兩地相距70 km)，采用對角線采樣的方式進行收集，每個采樣點采集4～5 kg，共計15個采樣點，品種均為赤霞珠。

葡萄酒果酒專用酵母購自安琪酵母股份有限公司；偏重亞硫酸鉀購自北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶(酶活力8 600 PGNU/g)，購自法國拉氟德公司；穩定同位素標準物質IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB= -10.449‰)和IAEA-N-2(硫酸銨，δ15Nair=20.3‰)，購自奧地利國際原子能機構；B2155(δ13CV-PDB=-26.98‰，δ15Nair=5.94‰)購自英國EMA公司；USGS64(δ13CV-PDB=-40.81‰)、USGS40(δ15Nair=9.52‰)、USGS55(δ2H=-28.2‰，δ18OV-SMOW=19.12‰)和USGS56(δ2HV-SMOW=-44‰，δ18OV-SMOW=27.23‰)購自美國地質勘探局。

1.2 主要儀器與設備

Vario PYRO cube 型元素分析儀、Isoprime100型穩定同位素比率質譜儀，德國Elementar公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；LC110-12勻漿機，佛山市翁開爾貿易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備與預處理 樣品經采集后，用去離子水清洗干凈后進行低溫干燥，去除表面水分。利用勻漿機將樣品進行勻漿后，平均分裝成3份，分別用于發酵前(全果、果汁和皮籽)與發酵后(酒和皮渣)樣品的制備。

全果：取1份勻漿樣品作為全果樣品；

果汁：取1份勻漿樣品，利用0.5 mm篩網進行過濾，獲得的濾液作為果汁樣品；

皮籽：制備果汁樣品時經篩網過濾后得到的濾渣為皮籽樣品；

酒：取1份勻漿樣品，先加入0.03%果膠酶和0.025%偏重亞硫酸鉀，攪拌均勻后再加入活化好的0.02%安琪釀酒活性干酵母。按照《GB/T 15037-2006 葡萄酒》[12]和《GB/T 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]標準進行發酵和檢測，將發酵液用多層紗布進行過濾后得到發酵完成后的葡萄酒樣品；

皮渣：待葡萄酒發酵過程結束后，經過濾后得到的殘渣作為皮渣樣品。

將制備的樣品先放置于-20℃冰箱中冷凍保存，在-80℃、20 Pa條件下冷凍干燥至恒重。干燥結束后使用液氮將全果、皮籽和皮渣樣品研磨至粉末，裝入棕色小瓶中，置于18℃以下的干燥器中保存，待測。本研究中的果汁和酒樣品均為冷凍干燥并研磨后的固體樣品。

1.3.2 穩定同位素比值測定 碳和氮穩定同位素：稱取6～7 mg待測樣品，放入錫箔杯(5 mm×9 mm)中包好，然后放入元素分析儀的固體樣品自動進樣盤中。樣品中碳、氮元素通過高溫燃燒后經氧化銅還原成CO2和N2，再進入穩定同位素比率質譜儀中進行檢測。檢測條件：元素分析儀中燃燒爐和氧化爐的溫度分別為1 150℃和850℃，載氣He(99.999%)，流量為250 mL·min-1。在分析過程中碳穩定同位素使用IAEA-CH-6、B2155和USGS64，氮穩定同位素使用IAEA-N-2、B2155和USGS40為標準物質，分別采用三點校正的方法對測試結果進行校正。

氫和氧穩定同位素：稱取約0.5 mg待測樣品，放入銀舟(8 mm×5 mm)中包樣，包好的樣品按編號放入元素分析儀自動固體進樣盤中，樣品中的氫、氧元素在經高溫裂解后分別轉化為H2和CO，進入穩定同位素比率質譜儀進行檢測。檢測條件：元素分析儀裂解爐溫度為1 450℃，He流量為150 mL·min-1。在分析過程中以USGS55和USGS56作為標準物質，對測試結果進行兩點校正。

參照下列公式計算穩定性同位素比值：

式中，R樣品為所測樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標準為國際標準樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，其中，δ13C以維也納美洲擬箭石(V-PDB)為基準，δ15N以大氣中氮氣為基準，δ2H和δ18O以維也納標準平均海洋水(V-SMOW)為基準。

1.4 數據處理

采用SPSS 18.0(美國IBM公司)軟件對數據進行單因素方差分析(one way-ANOVA)和皮爾遜相關分析，其中單因素方差分析采用鄧肯(Duncan)多重比較法。

2 結果與分析

2.1 發酵前葡萄中穩定同位素分布特征

發酵前，對葡萄各部分(全果、果汁和皮籽)固體品中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O進行比較分析，結果如圖1所示。δ13C的分布范圍為-25.0‰～-24.4‰，全果(-24.7‰) 與皮籽(-24.6‰)及果汁(-24.8‰)間δ13C值的差異不顯著。δ15N分布范圍為2.4‰～5.4‰，各部分樣品間均具有顯著性差異，全果(4.6‰)顯著高于皮籽(2.8‰)和果汁(3.8‰)，而果汁顯著高于皮籽。δ2H分布范圍為-26.9‰～-14.3‰，全果(-19.3‰) 與果汁(-20.0‰)之間δ2H值差異不顯著，但顯著高于皮籽(-22.9‰)。δ18O分布范圍在32.1‰～41.6‰，全果(34.4‰)與皮籽(34.3‰)之間δ18O值差異不顯著，但果汁(40.1‰)的δ18O值顯著高于全果與皮籽。經比較分析，除了δ13C外，發酵前各固體樣品(全果、果汁和皮籽)中δ15N、δ18O和δ2H均存在差異性。此外，全果中δ2H極差較大，跨度為10.3‰，而δ18O 極差較小，跨度為0.5‰。

注：不同小寫字母表示經單因素方差分析，樣本間存在顯著差異(P<0.05)。下同。Note: Different lowercases represent that significance exists between inter-samples after one-way ANOVA(P<0.05). The same as following.圖1 發酵前葡萄中穩定同位素比率Fig.1 Stable isotope ratio in grapes before fermentation

2.2 發酵后葡萄酒中穩定同位素分布特征

將釀酒葡萄發酵后，通過篩網過濾得到上清液(葡萄酒)與皮渣部分，收集兩部分樣品進行穩定同位素分析，各同位素比值分布情況略有不同(表1)。葡萄酒與皮渣中δ13C均值分別為-25.1‰和-25.2‰，無顯著差異；而δ15N、δ2H和δ18O值在酒和皮渣中差異較大，葡萄酒中δ15N值顯著低于皮渣，而δ2H與δ18O值均顯著高于皮渣，其中，δ2H差異較大，可能是由于添加的發酵劑導致同位素比值分餾[14]。綜上，發酵后的葡萄酒與固體皮渣樣品中除δ13C以外，其余穩定同位素比值均呈顯著性差異。

表1 發酵后葡萄酒中穩定同位素平均值與標準偏差Table 1 Average and standard deviation of stable isotopes in wine after fermentation /‰

2.3 發酵前后不同樣品中穩定同位素的變化及相關性分析

全果和皮籽經發酵后變為酒與皮渣，采用單因素方差法對發酵前后全果和酒，皮籽和皮渣中穩定同位素比值的差異與變化進行分析。由圖2可知，發酵前后穩定同位素特征分布均有不同。碳是生物體的骨架元素，也是參與生命代謝的重要元素[15]。酒和全果中δ13C值分別為-25.1‰和-24.7‰，皮渣和皮籽中δ13C值分別為-25.2‰和-24.6‰，酒與全果中δ13C 值雖無顯著差異，但皮渣中δ13C值顯著低于皮籽。氮是發酵過程中重要的元素，酒和全果中δ15N值分別為3.6‰和4.9‰，皮渣和皮籽中δ15N值分別為5.0‰和2.8‰，經對比發現δ15N值在發酵前后不同樣品中都具有顯著性差異。氫是質量最小的元素，其同位素比值易受到外界影響而發生分餾。酒和全果中δ2H值分別為-28.7‰和-19.3‰，而皮渣和皮籽中的δ2H值分別為-57.5‰和-22.9‰，由此可見，氫同位素在發酵過程中發生較大變化，以皮渣中的同位素變化跨度最大。氧是構成生物界與非生物界最重要的元素[16]。酒和全果中δ18O值分別為36.7‰和34.4‰，皮渣和皮籽中δ18O值分別為30.0‰和34.3‰，酒中δ18O值顯著高于發酵前全果，而皮渣中δ18O顯著低于發酵前的皮籽,由此可見δ18O值在發酵前后的變化趨勢不同。

通過對全果和酒、皮籽和皮渣中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O穩定同位素特征進行皮爾遜相關性分析(表2)，結果表明，全果和酒中對應相同元素的同位素比值相關性較弱且不顯著，葡萄酒δ15N與全果δ18O值呈極顯著相關，相關系數為0.66(P<0.01)。皮籽和皮渣中對應相同元素的同位素比值相關性較弱且不顯著，皮渣δ15N與皮籽δ18O值呈顯著相關，相關系數為0.61(P<0.05)。由此可見在該試驗條件下發酵對葡萄酒中穩定同位素有顯著影響。

圖2 葡萄酒發酵后穩定同位素特征Fig.2 Stable isotope characteristics of wine after fermentation

3 討論

本研究立足于我國新疆焉耆盆地的釀酒葡萄，分析了發酵前釀酒葡萄(全果、果汁和皮籽)與發酵后各樣品(葡萄酒和皮渣)中穩定同位素比值分布情況，初步探討了發酵前后穩定同位素比值變化，得到葡萄酒發酵前后各樣品穩定同位素比值變化的相關性。葡萄

表2 發酵后葡萄與葡萄酒中穩定同位素相關性Table 2 Correlation of stable isotopes in grape and wine after fermentation

是典型的C3植物[17]，本研究中釀酒葡萄的δ13C主要分布在-24.75‰附近，符合C3植物的穩定同位素比值分布范圍[18]。C3植物中δ13C易受到位置、海拔的影響[19-20]。新疆是我國高緯度地區，新疆的大棗[21]、梨[22]、甜瓜[23]等農產品的δ13C均值分別在-27.0‰、-26.0‰及-25.0‰附近。農業生產系統中的施肥(有機肥與化肥)[24-25]會影響農產品中δ15N值，使其比值發生變化。本研究發現釀酒葡萄不同部位(全果、果汁和皮籽)中δ15N值存在顯著差異，這也印證了δ15N在植物體中分餾具有差異性。δ2H和δ18O是具有地理指示性的穩定同位素，容易受到位置、海拔、海岸線等因素的影響[26-27]。本研究發現，新疆焉耆盆地產區釀酒葡萄中的δ2H和δ18O分別在-26.9‰～14.3‰和32.1‰～41.6‰范圍內。將釀酒葡萄發酵為葡萄酒的過程中，葡萄酒中的δ2H受到了人為及外部環境的影響。研究葡萄酒中的同位素可驗證產品的真實性，報道中多以葡萄酒中的乙醇為研究對象。本研究對發酵前后的全果、酒、皮籽、皮渣中各元素的穩定同位素比值進行對比分析，發現各元素的穩定同位素比值特征均有不同，發酵前后相同元素的同位素相關性不顯著主要歸因于發酵過程。基于本研究結果，為建立更加穩定的葡萄酒原產地數據庫，建議應結合不同的釀酒葡萄品種和產地以及不同的發酵工藝展開研究。

4 結論

本研究采用固體樣品分析法對發酵前釀酒葡萄各部位(全果、果汁和皮籽)與發酵后各樣品(酒和皮渣)中穩定同位素比值進行測定，發現不同樣品中除δ13C外，其余穩定同位素比值在發酵前后均具有顯著差異性。進一步對發酵前全果和發酵后葡萄酒與發酵前皮籽和發酵后皮渣進行相關性對比，發現各相同元素的穩定同位素比值相關性較小(P<0.05)。結果證明通過固體樣品分析法能對發酵前后各樣品中穩定同位素比值進行初步探索，為葡萄酒產品真實性鑒別提供了新思路。