ADAM12 在結直腸癌中的表達及其臨床意義

陳 銳，楊侃侃，江 兵，李啟信

（安徽醫科大學附屬巢湖醫院胃腸外科，安徽 巢湖 238000）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是目前世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均在各類惡性腫瘤中排名第3[1]。盡管近年來通過外科手術、放化療及靶向治療結直腸癌取得了一定的效果，但進展期結直腸癌的5 年生存率僅為50%左右，患者預后較差，尋找結直腸癌診斷和治療的新的靶向分子尤為重要[2]。既往研究發現，ADAM12 在多種實體腫瘤中異常高表達，包括肝癌[3，4]、胃癌[5，6]、子宮頸癌[7]、乳腺癌[8，9]、胰腺癌[10，11]等。但目前ADAM12 在結直腸癌中相關研究較少。為此，本研究收集徽醫科大學附屬巢湖醫院胃腸外科2020 年4 月-2021 年2 月行手術治療的83 例臨床樣本，利用免疫組化方法檢測ADAM12 在結直腸癌及鄰近癌旁組織中的蛋白表達水平，并分析其與臨床病理特征的相關性，探究ADAM12 在結直腸癌發生發展中的意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安徽醫科大學附屬巢湖醫院胃腸外科2020 年4 月-2021 年2 月行手術治療的83例患者的癌組織和癌旁組織標本，所有患者均行腹腔鏡或開腹行結直腸癌根治性切除術。納入標準：①患者術前通過腸鏡活檢病理、影像學檢查及術后病理均證實為結直腸惡性腫瘤；②所有標本收集均在術后半小時內放入10%福爾馬林液體中保存直至石蠟包埋；③所有患者癌組織均取自腫瘤全層并剔除壞死組織，癌旁組織取自距癌組織5 cm 以上的正常腸上皮組織。排除標準：①患者術前未進行任何治療（放療、化療），無重大心肺疾病等；②患者既往無其他部位惡性腫瘤治療史或結直腸惡性腫瘤手術后復發。本研究獲得安徽醫科大學附屬巢湖醫院醫學倫理委員會審查通過，實驗所收集標本均經患者或患者家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 羊抗人ADAM12 多克隆抗體為abcam 公司產品，通用型二抗試劑盒、山羊二抗試劑盒、DAB 顯色試劑盒均為Zsbio 公司產品。

1.2.2 免疫組化染色 將石蠟包埋的標本切為厚度為5 μm 的切片，依次經過3 道二甲苯和3 道100%、95%、80%乙醇進行脫蠟和脫水處理后抗高壓修復20 min，固定組織放在孵育盒上加3%雙氧水室溫孵育20 min，PBS 沖洗后加一抗ADAM12（1∶200），37 ℃孵育60 min 后再次PBS 沖洗，加DAB 顯色劑（顯微鏡下控制顯色時間，有陽性終止顯色時間），最后常規水洗、脫水、透明、封片。

1.3 免疫組化結果判定 通過免疫組化方法判定ADAM12 在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達水平。ADAM12 在結直腸癌細胞中染色強陽性結果為棕褐色或棕黃色，染色部位主要位于細胞漿和細胞膜，細胞核幾乎不染色。根據顯微鏡下細胞染色強度評分標準分為：無色（0 分）、淡黃色（1 分）、棕黃色（2 分）、棕褐色（3 分）；細胞著色細胞數評分標準為：0～25%（1 分）、25%～50%（2 分）、50%～75%（3 分）、75%～100%（4 分）。評分結果由染色強度×著色細胞數進行綜合評判，對染色強度得分和著色細胞數得分乘積＜4 分為ADAM12 低表達，對染色強度得分和著色細胞數得分乘積≥4 分為ADAM12 高表達。本實驗的結果由兩位病理科主治醫師復核后綜合判定。

1.4 統計學方法 本研究數據處理采用SPSS 20.0 軟件和GraphPad Prism8 進行統計學分析，ADAM12基因在結直腸腫瘤及癌旁組織中的表達水平之間比較采用GraphPad Prism8 配對t檢驗，ADAM12 基因在結直腸腫瘤及癌旁組織中的表達水平與結直腸癌的病理參數之間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ADAM12 在結直腸癌組織中的表達水平ADAM12主要在結直腸癌的胞漿和細胞膜中表達，呈棕褐色或棕黃色，在正常組織中呈低表達或不表達，見圖1。ADAM12 蛋白在結直腸癌中異常高表達，高于癌旁組織中的表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。83 例結直腸癌患者中ADAM12 高表達有56 例，低表達27 例，癌旁組織中高表達13 例，低表達70，結直腸癌患者中ADAM12 高表達占比高于低表達患者，差異有統計學意義（χ2=45.860，P＜0.05），見表1。

表1 ADAM12 基因在結直腸癌及癌旁組織中的表達[n（%）]

圖1 ADAM12 在結直腸癌及癌旁組織中的表達

圖2 結直腸癌中ADAM12 的表達

2.2 ADAM12 蛋白與結直腸癌患者臨床病理參數之間的相關性 不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、脈管侵犯以及神經侵犯的患者ADAM12表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM 分期的患者ADAM12 表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 ADAM12 與結直腸癌患者病理參數間的關系（n）

3 討論

ADAM12 是ADAM 家族的重要成員之一，位于染色體10q26 上，主要包括膜結合型ADAM12（ADAM12-L）和分泌型ADAM12（ADAM12-S）兩種形式。正常情況下，ADAM12 在人足月胎盤中表達豐富[12]。目前研究發現，ADAM12 在多個實體腫瘤中均出現表達異常上調并通過驅動腫瘤進展中的多個過程，包括腫瘤的侵襲轉移[13，14]、細胞凋亡[15]、EMT 過程[16，17]、細胞黏附[18]等。

ADAM12 在多種實體腫瘤中過度表達且與預后不良相關。張揚等[3]發現有超過68%的肝癌患者存在ADAM12 高表達。也有研究報道[5]，ADAM12-L mRNA 及蛋白質在胃癌組織中過表達，提示ADAM12-L 能促進胃癌的進展。研究發現[6]，ADAM12 在胃癌中的表達量明顯上調，且與胃癌細胞的惡性生長有關，其可能是通過與粘附分子的相互作用或信號分子的蛋白水解脫落以及其受體的反式激活引起的。在乳腺癌中，ADAM12 不僅呈現高表達，當敲除乳腺癌細胞系中的ADAM12 時可促進EMT 過程，抑制乳腺癌癌細胞的侵襲和遷徙[16]。Roy R 等[8]研究報道，ADAM12 的表達與乳腺癌的進展呈正相關?？傊?，ADAM12 在惡性腫瘤中的過度表達可能與腫瘤的發生發展密切相關。為了探究ADAM12 在結直腸癌組織和正常的癌旁組織中表達水平，本研究中利用免疫組化的方法檢測結直腸癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織中ADAM12 蛋白的表達量，結果發現ADAM12 在結直腸癌組織中表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），與吉冰等[19]的研究結果基本一致，表明在ADAM12 在結直腸癌中異常高表達可能促進結直腸癌發生發展。

腫瘤的侵襲和轉移是腫瘤患者死亡的主要原因。研究發現[20]，ADAM12 異常高表達不僅可以增加腫瘤的增殖，而且可以引起腫瘤轉移。據報道[17，20]，ADAM12 在促進腫瘤的遷徙和侵襲過程可能與EGFR/ERK 通路相關。有研究發現，ADAM12 通過調控肝癌細胞EMT，促進肝癌細胞增殖、侵襲，并且抑制ADAM12 可降低肝細胞增殖、侵襲能力；同時還發現肝癌細胞中ADAM12 的高表達與腫瘤的TNM分期顯著相關[3]。本研究中，ADAM12 高表達與結直腸癌的TNM 分期相關。白璐等[7]研究表明，子宮頸癌患者異常高表達的ADAM12 與腫瘤侵襲、TNM分期、淋巴結轉移密切相關。這些都提示ADAM12的異常高表達參與了腫瘤侵襲和遷徙并最終增強了腫瘤的轉移。本研究顯示，ADAM12 高表達與腫瘤的浸潤深度相關，這也說明ADAM12 具有向周圍組織侵襲和遷移的能力；同時，高表達的ADAM12 與淋巴結轉移和TNM 分期相關，說明高表達的ADAM12 能夠增強腫瘤向周圍組織轉移的能力。

總之，ADAM12 在結直腸癌中呈現過表達，而過表達的ADAM12 與結直腸癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期密切相關，說明ADAM12 在結直腸癌發生發展過程中可能起到促癌的作用并與結直腸癌的侵襲轉移密切相關，為ADAM12 作為結直腸癌診斷和預防的重要腫瘤學標志物以及作為結直腸癌的一個潛在的治療靶點提供理論依據。此外，本研究結果也存在一定不足之處，研究樣本相對較少，且研究結果尚未進行細胞功能試驗及動物實驗進一步驗證。