犬蠕形螨混合金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染的病原鑒定與診治

夏倫斌孫 立何燕飛孫桃桃

曹建文1,賈 哲1,徐光沛1

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院,安徽六安 237012;2.安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室,安徽 六安 237012)

蠕形螨(Follicle mite)寄生于人和哺乳動物的毛囊和皮脂腺內,已知有140 余種和亞種[1]。犬蠕形螨病是由犬蠕形螨(Demodexcanis)引起犬的一種常見而又頑固性的皮膚寄生蟲病,又稱犬毛囊蟲病或犬脂螨病[2]。臨床上感染蠕形螨患犬,若不能得到及時治療或治療效果不佳,常會導致繼發細菌及/或真菌等其他病菌感染,嚴重影響犬只的健康[3-4]。因此,臨床上及時對患犬確診,是有效治療的關鍵。研究表明,犬蠕形螨主要通過直接或間接接觸患犬及其周圍環境等途徑感染,初期以鼻部、眼睛、頭等周圍少毛或無毛部位為主,然后蔓延至頸部、四肢、腹部、背部[5],由于免疫力下降常引起全身性蠕形螨感染[6],其臨床癥狀多以脫毛、皮炎、瘙癢、紅斑、結痂以及伴有腥臭味為特征[3,7]。近年來,犬蠕形螨與細菌及/或真菌混合感染在犬皮膚病臨床上比較常見,約占15%～20%,患犬病程較長,治療周期長,治療效果不理想,而且特別容易復發[8],給臨床治療造成了困難。本研究通過對1 例疑似犬蠕形螨感染犬,采取隔離,臨床癥狀檢查,并結合血常規、生化指標、寄生蟲學和微生物學檢查等實驗室方法,確診引起患犬的病因,選擇適合藥物進行對因和對癥治療,觀察治療效果,為犬蠕形螨混合細菌感染的診斷和有效治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患犬來源 患犬為皖西學院小動物診療實驗實訓中心收留的校園流浪犬,雜交犬,約3歲,雌性,體質量約14.3 kg。

1.1.2 試劑藥品 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA),購自杭州濱和微生物試劑有限公司;BHI培養基,購自杭州百思生物技術有限公司;革蘭氏染液和Diff-Quik 染液,購自上海信帆生物科技有限公司;革蘭氏陽性和陰性菌生化檢測卡,購自法國梅里埃診斷產品(上海)有限公司;多拉菌素注射液(生產批號1825716),購自美國輝瑞(上海)動物保健品有限公司;鹽酸特比萘芬噴劑(生產批號20200401),購自天津保靈動物保健品有限公司;硫酸阿米卡星注射液(獸藥字080067009),購自黑龍江省北安市飛龍動物藥廠;地塞米松磷酸鈉注射液(獸藥字120152529),購自合肥中龍神力動物藥業有限公司;寵物營養補充劑,購自艾澌克(南京)生物科技有限公司;草本固元膏,購自乾元動物藥業有限責任公司;過氧化氫消毒液,購自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

1.1.3 儀器設備 SW-CJ-2FD 型超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;BC-2800VET 型血細胞分析儀,深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司;DT-480全自動生化分析儀,廣州東唐電子科技有限公司;GHP-9270型恒溫培養箱,上海齊欣科學儀器有限公司;BK6000生物顯微鏡,重慶奧特光學儀器有限公司;VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀,梅里埃診斷產品(上海)有限公司;其他儀器和耗材均由皖西學院小動物診療實驗實訓中心提供。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床檢查 對病犬進行體溫和全身病變檢查并記錄。

1.2.2 血常規和血液生化檢查 前肢靜脈采集血液于抗凝管和EP 管中,分別進行血常規檢查和血液生化分析。

1.2.3 寄生蟲與真菌檢查 先利用伍德氏燈和放大鏡進行真菌及體表寄生蟲檢查,然后進一步依據患病犬的體表病變,采用皮膚深層刮片法,即手持鈍刃刀片垂直于皮膚、以中等壓力沿毛發生長方向進行刮片,在不同患處采集3張皮膚刮片并鏡檢;同時用手術刀片刮擦病變部位皮膚并將收集的皮膚滲出物樣本涂布到玻片上,干燥后用Diff-Quik染液染色,進行皮膚細胞學檢查[9]。觀察是否有蠕形螨等寄生蟲及真菌性微生物感染。

1.2.4 細菌學檢查、病菌分離與鑒定 采用滅菌棉棒于皮膚潰瘍處擦拭,蘸取滲出液或膿液,轉接到TSA 培養基中,37 ℃過夜培養后觀察病菌生長情況。再依據不同菌落形態或顏色挑選單個菌落進行純化培養,然后轉接到BHI培養基培養,離心收集細菌后,用滅菌NaCl溶液(4.5 g/L,p H 6.5)調制菌懸液麥氏比濁度至0.55,然后按照VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀使用說明書進行鑒定。

1.2.5 分離菌藥敏試驗 在超凈工作臺內,采用K-B紙片擴散法進行敏感藥物篩選[10],用接種環挑取分離菌株單個菌落接種到TSA 培養基平板上,加100μL滅菌蒸餾水,用三角形涂布棒過火焰后,均勻涂布,再分別將8類9種藥敏紙片緊貼于培養基表面,然后放置于恒溫培養箱培養24 h后,觀察并測量記錄抑菌圈直徑的大小,參考美國國家臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標準[11]判定藥敏試驗結果。

1.2.6 確診與治療 依據檢查結果,分析并確診患病犬的病因,選擇適合藥物進行治療。治療前推去全身犬毛,用過氧化氫消毒液(30.0 g/L)清洗犬身,吹干后,單獨飼喂。采用抗寄生蟲和抗菌治療,同時結合對癥和提高犬體免疫力等綜合措施進行治療。

2 結果與分析

2.1 一般臨床檢查結果

犬體溫為38.4 ℃,無異常;體表臨床檢查可見全身多處大面積脫毛、丘疹性皮炎并伴有紅斑和結痂性潰瘍(圖1-A、B);面部和眼眶周圍脫毛、彌散性脫屑、紅斑和丘疹性皮炎(圖1-C);四肢端及爪部有嚴重的脫毛、紅斑及皮疹(圖1-D);此外,患病犬消瘦、喜躲避在角落里,食欲基本正常。

圖1 患病犬全身性病變Fig.1 Systemic lesions in sick dog

2.2 血常規檢查結果

由表1可知,患犬白細胞數和中性粒細胞數顯著升高,紅細胞體積分布寬度和血小板數均略有升高,其他指標均在參考值范圍,結合一般檢查和癥狀,表明患犬有嚴重慢性感染和炎癥。

表1 治療前血常規指標檢測結果Table 1 Test results of blood routine indicators before treatment

2.3 血液生化檢查結果

由表2可知,血液總蛋白含量升高,白蛋白和血鈣含量略有降低,γ-谷氨酰基轉移酶略有升高,其他各項指標均在參考值范圍。血液總蛋白主要由白蛋白和球蛋白組成,患病犬白蛋白含量略有降低,而總蛋白含量升高,這可能與患犬因全身感染和炎癥引起血液免疫球蛋白含量升高有關;白蛋白和血鈣含量略有下降,可能因為全身感染導致營養攝入不足引起的。

表2 治療前血液生化指標檢測結果Table 2 Test results of blood biochemical indexes before treatment

2.4 寄生蟲與真菌檢查結果

經體表檢查,未見有疥螨、蜱蟲、跳蚤等體表寄生蟲,伍德氏燈檢查未檢出犬小孢子菌感染;進一步皮膚刮片鏡檢,觀察到蠕形螨蟲體(圖2),同時未檢出真菌孢子;皮膚細胞學檢查也未見有真菌性致病菌。

圖2 皮膚刮片鏡檢見有蠕形螨蟲體(黑色箭頭所示,×10)Fig.2 Demodex canis observed by skin scraping microscopy(shown by black arrow,×10)

2.5 細菌學檢查、病菌分離與革蘭氏染色結果

細菌分離培養獲得2種呈不同顏色的菌落,一種呈圓形不透明、邊緣整齊光滑的乳白色菌落,另一種為圓形、邊緣整齊不透明的金黃色菌落,由此可初步判斷為不同的兩種細菌株(圖3),進一步挑選兩種菌株進行純化培養(圖4)。將金黃色菌株和乳白色菌株分別命名為細菌Ⅰ和細菌Ⅱ。革蘭氏染色鏡檢顯示細菌Ⅰ為呈不規則葡萄串狀排列的革蘭氏陽性球菌(圖5),細菌Ⅱ為呈單個或雙個排列的革蘭氏陰性短桿菌(圖6)。

圖3 皮膚病灶處微生物培養(開放箭頭所示為白色菌落,鉆石箭頭所示為金黃色菌落)Fig.3 Microbial culture result of skin lesions(white colony as shown by open arrow and golden colony as shown by diamond arrow)

圖4 2種分離菌純化培養(左為乳白色菌落,右為金黃色菌落)Fig.4 Purified culture of two isolated bacteria(milky white colony on left and golden yellow colony on right)

圖5 細菌Ⅰ革蘭氏染色鏡檢結果(×1000)Fig.5 Gram staining and microscopic examination result of bacteriaⅠ(×1000)

圖6 細菌Ⅱ革蘭氏染色鏡檢結果(×1000)Fig.6 Gram staining and microscopic examination result of bacteriaⅡ(×1000)

2.6 分離菌鑒定結果

細菌Ⅰ和細菌Ⅱ分別用革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌生化鑒定卡在VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀上進行鑒定,依據細菌的生化反應結果,結合細菌菌落、染色和形態特點,細菌Ⅰ和細菌Ⅱ分別鑒定為金黃色葡萄球菌(置信度為97%)和大腸桿菌(置信度為99%)。

2.7 藥敏試驗結果

由圖7和表3可知,細菌Ⅰ僅對丁胺卡那霉素敏感,而對萬古霉素、頭孢氨芐、呋喃唑酮、氨芐西林、氟苯尼考、強力霉素、頭孢曲松、環丙沙星等8種藥物均耐藥;細菌Ⅱ對萬古霉素、丁胺卡那和環丙沙星等藥物敏感,對頭孢氨芐和頭孢曲松為中度敏感,對呋喃唑酮、氨芐西林、氟苯尼考、強力霉素等藥物耐藥。可見,細菌Ⅰ和細菌Ⅱ對丁胺卡那霉素均敏感。

表3 患病犬病灶分離菌株藥敏試驗結果Table 3 Results of drug sensitivity test for isolated strain from lesions of diseased dog

圖7 藥敏試驗結果(A為細菌Ⅰ;B為細菌Ⅱ)Fig.7 Results of drug sensitive test(A is bacteriaⅠ;B is bacteriaⅡ)

2.8 診斷與治療效果觀察

依據血常規、生理生化指標、寄生蟲學和微生物學檢查與鑒定結果,結合臨床癥狀,患犬確診為犬蠕形螨混合金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染。

治療前推去全身毛發,患處用過氧化氫清洗消毒后吹干。采用多拉菌素(10 mg/m L)皮下注射,按0.3 mg/kg體質量給藥,每周1次,連續給藥6周;用丁胺卡那霉素(50 000 U,50 mg/m L)肌肉注射,按12.5 mg/kg體質量給藥,每日2次,早晚各1次,連續給藥7 d;地塞米松(0.4 mg/m L)肌肉注射,按2.5 m L/次給藥,每日1次,連續給藥5 d;草本固元膏(含黃芪、人參葉、枸杞、沙棘等),采用涂抹在犬的鼻端讓其舔舐,約10 g/次,每日2次,早晚各1次,連續6周;寵物營養補充劑(含茶多酚、維生素B族等,0.65 g/片),每日5片,碾碎拌料飼喂,連續6周;為了預防繼發真菌感染,采用特比萘芬噴劑(1%)噴于患處及其周圍,每3 d 1次,連續6周;此外,每周用除螨香波洗浴1次,并用干毛巾擦干。通過以上綜合治療措施,患病犬治療效果明顯,治療前的全身皮膚癥狀基本治愈,毛發生長(圖8)。經皮膚刮片鏡檢,未再發現蠕形螨蟲體;血常規和生化指標檢查未見異常,各項指標均在正常范圍。為了鞏固治療效果,一個療程結束后,休藥1周,再連續給藥3 d,其中多拉菌素每周1次,連續給藥3周。

圖8 治療后患病犬全身病灶恢復情況Fig.8 Recovery of systemic lesions in sick dog after treatment

3 討論

近年來,隨著人們對伴侶動物疫苗接種的認知越來越高,犬瘟、犬細小病毒病等傳染性疾病發病率呈下降趨勢,但犬的寄生蟲性皮膚病,如疥螨病、蠕形螨病等卻在犬的臨床疾病中所占比例呈現升高的趨勢,尤其在高溫潮濕季節,占比高達20%～30%[12],嚴重危害犬的健康,同時也給犬主人帶來情感上、生活上和經濟上的負面影響。犬蠕形螨病是犬常見的寄生蟲性皮膚病之一,以引起犬只脫毛、紅斑、色素沉著、繼發膿皮病和瘙癢癥為主要特征,依據發病程度分為犬局部蠕形螨病和全身蠕形螨病[9]。全身性蠕形螨病為一種較難以治療的皮膚病,若不能得到有效治療則很難治愈,甚至危及犬的生命[13]。該病在臨床上確診難度不大,首先依據臨床病癥是否與犬蠕形螨病病癥相符合或相似,可初步疑似蠕形螨感染,進一步通過拔毛法、透明膠帶粘貼法或皮膚刮片法制成玻片,進行寄生蟲學檢查,若觀察到蠕形螨蟲體或其蟲卵即可確診。本病例患犬臨床癥狀符合全身蠕形螨病的基本特征,經皮膚刮片檢查檢出蠕形螨蟲體,說明有蠕形螨感染。

犬蠕形螨病是一種慢性感染過程,常引起犬的營養不良和免疫力降低,容易造成繼發細菌及/或真菌混合感染,在臨床診斷上需要特別加以注意,否則容易造成漏診,導致治療效果不佳。本病例通過微生物培養,從患犬病灶處分離得到1株革蘭氏陽性球菌和1 株革蘭氏陰性桿菌,經VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀分別鑒定為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀依據微生物的生化代謝特點,結合現代自動化技術,實現對菌株快速和自動化鑒定,可靠性和重復性極高,非常適合臨床快速、準確鑒定病原菌[14-15],相較于微生物傳統生化鑒定方法,避免了繁瑣、耗時的鑒定過程,同時相較于16S r RNA 基因序列鑒定方法[16],具有成本低、易操作和效率高的特點。因此,本研究中分離菌株鑒定結果可靠,也比較經濟。

研究表明,因抗生素的不科學使用,導致犬源細菌呈多重耐藥現象比較普遍[17-19]。為了對患犬進行有效治療,本病例對分離菌進行了藥敏試驗,分離的金黃色葡萄球菌僅對丁胺卡那霉素敏感,而對其他8種藥物均耐藥,分離的大腸桿菌對丁胺卡那霉素、萬古霉素和環丙沙星等藥物敏感,對頭孢曲松和頭孢氨芐為中度敏感,而對呋喃唑酮等其他4種藥物耐藥。可見,選擇敏感藥物在寵物臨床感染性疾病治療上至關重要,起到事半功倍的作用,否則因使用的藥物不敏感而導致治療效果不佳,甚至引起更嚴重后果。目前,國內寵物醫院在進行細菌性感染的治療過程中,多數情況下沒有進行敏感藥物篩選或可能因不具備相應實驗條件,存在盲目選擇抗生素進行治療現象,這一方面可能導致治療效果不理想,另一方面也是抗生素的不科學使用,給環境和人類健康帶來不利影響,這應該引起臨床獸醫師的高度重視。

本病例在治療過程中,采用了抗蟲、抗菌、對癥和提高犬體免疫力等綜合治療措施。選擇多拉菌素進行抗蠕形螨治療,多拉菌素具有長效、安全和低殘留等特點,為目前公認的阿維菌素族中最優的體內外寄生蟲藥物之一,同時還具有抗炎活性[20];選用丁胺卡那霉素進行抗菌治療,因分離鑒定的葡萄球菌和大腸桿菌對丁胺卡那霉素均敏感,避免了同時使用多種抗生素;為了進一步改善犬機體炎癥反應、以及提升抗毒素、抗過敏等作用,使用地塞米松進行肌肉注射,研究表明,地塞米松聯合抗生素進行治療,能夠減輕炎癥反應、改善免疫功能[21],但不宜長期使用,因地塞米松是一種腎上腺糖皮質激素,長期使用會引起腎上腺皮質功能不全等毒副作用,因此,本病例治療中地塞米松給藥期為5 d;為了提升患犬的抗病力,還用中藥膏劑和維生素等營養補充劑進行補飼,以促進代謝機能,增強機體免疫力;為了預防繼發真菌感染,應用特比萘芬抗真菌噴劑進行外用;此外,為了去除犬體表污物保持清潔,每周用除螨香波給患犬洗浴,洗浴后將犬身擦干或吹干,以免潮濕給螨蟲提供適宜的生長環境,影響治療效果。因蠕形螨感染治療周期較長,治療不徹底容易復發,為了鞏固治療效果,本病例進行了加強治療。通過以上措施綜合治療,患犬取得了良好治療效果,可為犬蠕形螨混合細菌感染的診斷與治療提供參考。