基于氧化應激研究苦豆子不同提取物的肝毒性機制

劉學楠，李 芳，華永麗，紀 鵬，姚萬玲，魏彥明

甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)屬豆科槐屬植物。1977年被收入《中華人民共和國藥典》，是甘肅、內蒙古、寧夏等省份重要的中藥植物資源和生態植被組成部分。苦豆子具有清熱解毒、除濕的作用，生物堿、黃酮和糖類為主要活性成分[1]，對胃腸道等疾病具有很好的治療作用[2]。Wang等[3,4]發現苦豆子生物堿主要為喹諾酮類，其在抗氧化、抗寄生蟲和抗菌等方面發揮重要作用[5]。研究發現苦豆子黃酮類成分對乙肝病毒有一定的拮抗作用[6]。目前，國內市場上已形成了以生態環境保護、特色產品開發及區域發展的苦豆子植物產業鏈。

在傳統應用中，苦豆子從未因為毒性而引起關注。近年來，藥物性肝損傷成為我國非感染性肝病的第二大病種，是歐美國家急性肝衰竭的首要病因，比例高達60%[7]。有關中藥導致肝毒性的臨床案例報道也日益增多，其潛在的毒性也成為國內外研究的熱點[8]。前期急性毒性實驗發現，苦豆子提取物對大鼠肝臟具有一定的毒性[9]。肝臟作為機體代謝和發揮解毒功能的主要器官，其毒性的研究具有重要的意義。目前有關苦豆子引起肝臟毒性的具體作用機制仍不明確。因此，本文通過亞急性毒性實驗，觀察水煎煮(WD)、水超聲(WU)、乙醇回流(ER)和乙醇超聲(EU)四種提取物給藥后對大鼠一般行為學、組織形態學、氧化應激指標的影響，并通過測定給藥后大鼠血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)含量、肝臟中氧化應激指標還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及核因子紅系2相關因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、SOD1、SOD2蛋白的表達與分布情況，探討苦豆子對大鼠的肝毒性作用機制，為苦豆子臨床基礎研究提供科學數據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦豆子采自甘肅武威地區，經甘肅農業大學動物醫學院中獸醫學教研室魏彥明教授鑒定為豆科植物苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)。植物鑒定后被保存在甘肅農業大學中獸醫實驗室植物標本室(NO.KDZ20180910)。

AST、ALT、GSH、SOD、MDA測定試劑盒由南京建成有限公司提供，生產批號分別為20200620、20200623、20200622、20200624、20200624。2.5%戊二醛電鏡固定液購買于北京索萊寶生物有限公司。

兔多克隆抗體(一抗)SOD1(bs-10216R)、SOD2(bs-323402R)購于北京博奧森生物有限公司；大鼠單克隆抗體(一抗)Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1010-ap)、β-actin以及二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse均購于武漢三鷹生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、上樣緩沖液(Loading Buffer)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TEMED、Bis-Acr、SDS-PAGE分離膠/濃縮膠緩沖液、甘氨酸、三甲醇氨基甲烷(Tris)、PVDF膜、脫脂奶粉、磷酸鹽緩沖液、吐溫80均購于北京索萊寶科技有限公司；ECL發光液購于南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白電泳彩虹Marker購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠4～6周齡，雌性35只，雄性40只，體重(180 ± 20)g，由中國科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心提供，許可證編號(SCXX(甘)2015 -0001)。室溫調整在23±1 ℃，濕度在50%±5%，12 h光照和12h黑暗環境交替進行，標準飲食，自由飲水。所有大鼠適應性飼養7天后，進行實驗操作。動物福利和實驗過程嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》(中國科技部，2006)相關規定，由甘肅農業大學動物倫理委員會監督執行。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物制備

樣品粉碎后過40目篩。分別稱取40 g苦豆子按以下4種方法提?。孩?5%乙醇回流提取(ER)，加醇量為10倍。②采用水煎煮提取(WD)，加水量為10倍。①②均浸泡1 h，加熱煎煮2 h，濾過。③采用75%乙醇超聲提取(EU)，加醇量為10倍，浸泡1 h，超聲提取40 min，濾過，收集濾液。④采用水超聲提取(WU)，加水量為10倍，浸泡1 h，超聲提取40 min，濾過，收集濾液。將4組濾液分別濃縮后定容至1 g/mL，冷藏，備用。

1.3.2 劑量選擇與動物分組

根據實驗室前期苦豆子乙醇回流提取物的亞急性毒性實驗結果以及毒性實驗劑量指導原則，選擇1/8 LD50作為毒性研究劑量[9]。WD、WU、EU、ER LD50分別為38.397、24.994、19.957、18.536 g/kg。根據大小鼠體表面積直接換算[9]WD、WU、EU、ER組生藥劑量分別為2.228、1.450、1.158、1.076 g/kg。實驗采用隨機數字表法分為10組，分別為WD雌性組(7只)、雄性組(8只)，WU雌性組(7只)、雄性組(8只)，EU雌性組(7只)、雄性組(8只)，ER雌性組(7只)、雄性組(8只)，雌性Control組(7只)、雄性Control組(8只)。每天早晨固定時間稱重灌胃。空白組給予等量生理鹽水，每天一次，連續灌胃30天。

1.3.3 一般行為學觀察

給藥期間觀察大鼠皮毛狀態、精神狀況、體重、體溫、飲食、尿量及糞便形狀色澤等一般行為學狀態。

1.3.4 樣品采集與處理

實驗結束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采集血液，分別用加EDTA-K2抗凝劑和不加抗凝劑的兩種采血管收集血液，一部分用于血液生理學分析，另一部分靜置1 h，4 ℃下3 000 rpm離心10 min，收集血清置-80 ℃下保存備用?？焖偾腥? cm3左右固定于2.5%戊二醛中進行肝臟超微組織形態學觀察。肝臟右葉固定于10%中性福爾馬林用于組織病理學觀察。其余進行臟器稱重并計算臟器系數(臟器系數=臟器重量/體重)，并剪碎-80 ℃下保存備用。

1.3.5 血清生化與肝氧化應激指標檢測

依照生化試劑盒(南京建成)說明書分別檢測ALT、AST水平。嚴格按照說明書分別檢測各組大鼠肝組織中GSH、MDA和SOD含量。

1.3.6 肝臟組織病理切片檢測

肝組織樣品經10%中性福爾馬林固定15天后，石蠟包埋，切片(厚度：4 μm)，蘇木精-伊紅(HE)染色，并通過Leica DFC顯微拍照系統采集照片。肝組織固定于2.5%戊二醛后4 ℃過夜，包埋，切片，染色，電子顯微鏡用于超微形態學觀察。

1.3.7 蛋白免疫印跡檢測(Western blotting)

取各組大鼠肝臟，加入適量裂解液以及蛋白酶抑制劑，置于冰上裂解，低溫勻漿30 min，提取蛋白。采用BCA法進行各樣品蛋白濃度測定。吸取50 μg蛋白樣品用于SDS-PAGE(5%濃縮膠，10%分離膠)檢測，電泳結束后采用0.22 μm PVDF膜進行蛋白濕轉，轉膜1.5 h。5%脫脂奶粉封閉，封閉時間2 h。一抗SOD1(1∶500)、SOD2(1∶1 000)、Nrf2(1∶2 000)、HO-1(1∶6 000)和β-actin(1∶5 000)，分別4 ℃過夜孵育；二抗HPR-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(1∶5 000)，均于室溫孵育1h。二抗孵育結束后用TBST洗滌，隨后加入ECL化學發光液，置于Amersham Imager 600化學發光儀(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden)進行ECL化學發光信號的采集與拍照。運用Image J 軟件對各組WB條帶灰度值進行分析。

1.3.8 免疫組化檢測

從組織蠟塊切下4 μm厚的連續切片進行免疫組化，脫蠟處理，用3% H2O2室溫進行阻斷內源性酶，PBS洗滌，采用檸檬酸鈉緩沖液煮沸15 min，進行抗原熱修復。BSA 37 ℃封閉30 min，PBS洗滌，一抗4 ℃過夜孵育。PBS洗滌，37 ℃孵育二抗30 min。PBS洗滌，DAB鏡下顯色，水洗終止反應，蘇木精復染，分化，水洗返藍，脫水封片，顯微鏡拍照分析。

1.3.9 統計方法與相關性分析方法

2 結果

2.1 一般行為學考察

整個實驗過程中，每組大鼠精神狀態、營養狀況良好，被毛整潔、平滑而有光澤。給藥組相比較對照組體重增長緩慢，采食量降低，而飲水量無明顯變化(見圖1)。

圖1 苦豆子不同提取物對大鼠的一般行為學影響Fig.1 Effect of different extracts of Sophora alopecuroide on rats general behavior( =5)

2.2 苦豆子不同提取物對臟器系數的影響

ER雄性組腎臟系數相比較空白組明顯升高(見圖2，P<0.05)。不同提取物給藥組肝臟系數相比較空白組呈現升高趨勢，其中WD雄性組、WD雌性組、WU雌性組有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 苦豆子不同提取物對大鼠臟器系數的影響Fig.2 Effect of different extracts of Sophora alopecuroides on rats organ coefficients( =5)

2.3 苦豆子不同提取物對AST、ALT指標的影響

AST、ALT是肝損傷的敏感性指標。如圖3所示，苦豆子不同提取物給藥后AST指標在雄性大鼠各組呈顯著性升高(P<0.01)，雌性WU組相比較空白組顯著性升高。ALT在雄性大鼠中呈上升趨勢，尤其在WD與ER組有顯著性而在雌性大鼠血清中WD、WU、EU均發生顯著性升高。

圖3 苦豆子不同提取物對AST、ALT指標的影響Fig.3 Effects of different extracts of Sophora alopecuroides on AST and ALT indexes( =5)

2.4 苦豆子不同提取物對大鼠氧化應激指標的影響

大鼠肝臟組織氧化應激指標檢測結果表明，與空白組相比較，四種提取物給藥后各組雌雄大鼠肝組織氧化應激產物MDA含量明顯升高(P<0.05)，雄性大鼠肝臟GSH含量和SOD含量顯著降低(P<0.05)(見表1)。雌性大鼠GSH給藥各組與空白相比較有上升趨勢，其中WD明顯升高(P<0.001)(見表2)。結果表明苦豆子提取物可造成肝臟氧化損傷。

表1 不同提取物對雄性大鼠氧化應激指標的影響Table 1 Effect of different extracts on male rats oxidative stress indexes( =5)

表2 不同提取物對雌性大鼠氧化應激指標的影響Table 2 Effect of different extracts on female rats oxidative stress indexes( =5)

2.5 組織病理學觀察

肝臟HE染色檢測發現，同空白組相比較，苦豆子不同提取物給藥組均出現不同程度的肝細胞壞死。EU、ER組出現明顯的炎癥反應(見圖4)。對大鼠各組肝臟進行電鏡超微形態學觀察，不同提取物給藥后，肝臟出現明顯的自噬情況，且肝細胞核形態發生改變，皺縮。肝臟線粒體發生嵴消失、腫脹等，尤以WD組最為明顯(見圖5)。從以上組織形態學結果中發現苦豆子可以通過發生炎癥以及損傷線粒體從而對肝臟造成一定損傷。

圖4 苦豆子不同提取物對大鼠肝臟HE染色觀察的結果 Fig.4 HE staining results of rat liver by different extracts of S.alopecuroides注：黃色箭頭代表炎癥；綠色箭頭代表壞死。Note:Yellow arrow:Inflammation;Green arrow:Necrosis.

圖5 苦豆子不同提取物對大鼠肝臟超微形態學觀察的結果Fig.5 Ultramorphologic observation results of different extracts of S.alopecuroides on rat liver注：紅色箭頭代表線粒體輕度腫脹；黃色箭頭代表自噬；綠色箭頭代表糖原顆粒。Note:Red arrow:Mitochondria slight swelling;Yellow arrow:Autophagy;Green arrow:Glycogen.

2.6 苦豆子不同提取物對Nrf2/HO-1信號通路的影響

通過免疫組織化學定位表達氧化應激Nrf2/HO-1通路中SOD1、SOD2、Nrf2、HO-1等關鍵蛋白發現Nrf2主要分布于肝細胞胞漿以及在膽管上皮細胞等。如圖6所示，WD、WU、EU、ER各組給藥后Nrf2蛋白表達明顯降低，其中雄性組WD、WU、EU組Nrf2蛋白與空白相比較有顯著性差異(P<0.05)，雌性大鼠WD、EU、ER組Nrf2蛋白表達顯著性降低(P<0.05)。HO-1蛋白主要分布于肝血竇中(見圖8、圖9)，且四種提取物大鼠給藥后表達均顯著性降低(P<0.05，見圖6)。SOD1主要分布于肝血竇中，蛋白在雌性大鼠肝臟中表達均顯著性降低，而在雄性大鼠肝臟也呈下降趨勢，WD、ER組最為明顯(P<0.05)。SOD2主要分布在肝細胞胞漿中，在雄性各組大鼠肝臟表達中顯著性降低，而在雌性大鼠各組中呈上升趨勢，與空白組相比較WD、WU、ER有顯著性差異(見圖7)。

圖6 苦豆子不同提取物對大鼠Nrf2、HO-1的影響(n = 3)Fig.6 Expression of Nrf2 and HO-1 in different extracts of S.alopecuroides (n =3)

圖7 苦豆子不同提取物對大鼠對肝臟SOD1、SOD2蛋白表達的影響(n = 3)Fig.7 Protein expression of SOD1 and SOD2 in liver of rats with different extracts of S.alopecuroides (n =3)

圖8 苦豆子不同提取物作用下的雄性大鼠肝臟免疫組化圖Fig.8 Liver immunohistochemistry of male rats of different extracts of S.alopecuroides注：黃色箭頭表示目的蛋白。Note:Yellow arrow:Target protein.

圖9 苦豆子不同提取物作用下的雌性大鼠肝臟免疫組化圖Fig.9 Liver immunohistochemistry of female rats of different extracts of S.alopecuroides注：黃色箭頭表示目的蛋白。Note:Yellow arrow:Target protein.

3 討論與結論

肝臟系數的變化可以作為肝臟發生病變的一個重要指標?？喽棺硬煌崛∥锝o藥后大鼠肝臟系數明顯升高。肝臟系數的升高提示肝臟可能發生水腫、炎癥等反應[11]。肝臟組織病理學觀察發現肝細胞存在壞死，炎癥細胞增多。通過對ALT、AST的肝臟損傷敏感性指標檢測[11]發現，不同提取物給藥后各組大鼠血清中ALT、AST水平不同程度地升高。說明苦豆子提取物長期給藥后可以造成肝功能受損，這與文獻報道一致[13,14]。為了進一步對苦豆子不同提取物肝臟毒性進行研究，本論文對肝臟進行微觀形態學觀察，發現大鼠肝臟線粒體腫脹，甚至嵴消失，并有明顯的自噬現象。其中，自噬是機體清除異物，對外界不利因素做出的一種反應[13]?？喽棺犹崛∥锝o藥后大鼠肝臟發生明顯的自噬現象，基礎水平的自噬對細胞是一種保護性作用，但過度自噬會引起自噬性細胞死亡甚至加速疾病的進展[14]，同時Ravanan等[15]證明通過抑制自噬可以降低NF-κB通路造成的炎癥反應?？喽棺硬煌崛∥锝o藥后大鼠肝臟自噬程度增加，可能是苦豆子通過增加自噬來加速肝臟毒性。

線粒體是細胞的能量代謝中心，在細胞增殖、遺傳信息傳遞、免疫調節和細胞生長周期調控、細胞凋亡等過程中發揮重要作用。同時也是細胞產生ROS類物質的關鍵場所，線粒體損傷功能障礙可引起機體代謝異常和器官功能衰退[16]。因此線粒體的損傷也有可能是肝臟發生毒性的重要原因，而本研究通過形態學觀察發現，苦豆子不同提取物給藥后大鼠肝臟線粒體發生腫脹，甚至嵴消失，尤其在WD組中表現最為明顯。究其原因可能是線粒體損傷，引起ROS自由基生成增多，最終引起機體器官功能障礙[17,18]。本研究通過測定MDA、GSH、SOD等相關氧化應激指標后發現，大鼠肝臟毒性與氧化應激存在明顯的相關性?？喽棺硬煌崛∥镌诖菩耘c雄性大鼠給藥后中均可以使氧化應激指標發生不同程度的顯著性變化，其中MDA顯著性升高，SOD與空白組相比較均發生顯著性降低。MDA是脂質過氧化的最終產物，能反映脂質過氧化的程度，從而反映肝細胞損傷的程度[19]。在正常情況下，SOD能將超氧化物轉化為H2O2，CAT能將H2O2轉化為H2O，而GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內的超氧離子及其他自由基，從而防止肝細胞損傷。事實上氧化應激在許多疾病的發病機制中都起著至關重要的作用，如結腸炎，動脈粥樣硬化以及阿爾茨海默癥等[20-22]。本研究發現苦豆子引起肝損傷主要機制為氧化應激。

Nrf2信號通路是機體內主要氧化應激抗氧化的主要通路，在正常情況下，Nrf2主要與Keap1結合形成一個復合物存在于細胞漿中[23,24]，保持較低的水平以維持細胞穩態，當機體受到外界刺激，例如藥物刺激以及氧自由基等的存在會使Nrf2與Keap1形成的復合物分離，Nrf2蛋白積累并移至細胞核內。在細胞核中，Nrf2與抗氧化反應元件ARE結合，誘導下游抗氧化蛋白HO-1、SOD1的表達[25]。SOD2主要分布線粒體中，是線粒體中清除氧自由基保護線粒體內環境穩定關鍵蛋白，其活性會隨著機體內ROS的改變而變化[26]。HO-1、SOD1可以通過催化血紅素降解生成膽紅素，CO和Fe2+這些都可以發揮積極的抗氧化作用[26]。SOD2又稱Zn-SOD，可以清除超氧陰離子[28]。Western blotting結果顯示雄性組WD、WU、EU提取物給藥后大鼠肝臟Nrf2蛋白與空白相比較有顯著性差異，HO-1蛋白在四種提取物大鼠給藥后表達均顯著性降低(P<0.05，見圖6)，SOD1蛋白在雌性大鼠肝臟中表達均顯著性降低，而在雄性大鼠肝臟也呈下降趨勢，WD、ER組最為明顯(P<0.05)，SOD2蛋白在雄性各組大鼠肝臟表達中顯著性降低，而在雌性大鼠各組中呈上升趨勢，與空白組相比較WD、WU、ER有顯著性差異。雖然雌雄大鼠指標變化存在差異，但都能通過影響大鼠肝氧化應激指標而造成肝毒性。雌性大鼠在氧化應激狀態下可能為了維持體內的平衡通過代償性來恢復抗氧化功能。在前期進行急性毒性實驗時發現，雄性小鼠對不同提取物的毒性更為敏感，死亡率高[10]，且雌雄大鼠生理結構不同，這也可能導致各項指標在雌雄大鼠中表現出一定的差距。Chen等[29]對金鐵鎖提取物進行小鼠和大鼠的急性和亞急性毒性實驗時，也同樣發現雌雄大鼠指標出現明顯差異。

綜上所述，苦豆子提取物可以造成肝毒性，其毒性主要是調控Nrf2/HO-1通路中相關蛋白造成機體氧化應激。