基于網絡藥理學的益母草治療產后腹痛的潛在分子機制研究

楊 勇，張樂樂，盛菲亞，李 維，陳加容，鄒 亮，楊 林

1成都大學藥學院；2成都大學基礎醫學院，成都 610106； 3成都大學附屬醫院藥劑科，成都 610081；4成都大學食品與生物工程學院，成都 610106

產后腹痛，也稱為“宮縮痛”“產后痛”，是指孕婦分娩后1～3日內，由于子宮的收縮恢復作用，產婦的腹部會產生類似于經期的陣痛[1]。臨床上，西醫對產后腹痛較嚴重的患者多采用阿片類鎮痛藥物進行干預，如舒芬太尼，然而此類鎮痛藥物多會引起一定程度的不良反應，如興奮嘔吐中樞而造成惡心嘔吐，或使迷走神經興奮而導致消化功能失調[2]。中醫理論認為，產后腹痛多為氣血運行不暢所致，包括血虛和血瘀兩種證型[3]，中醫臨床上治療產后腹痛多采用溫經祛癖法祛瘀止痛，同時采用補益氣血法補氣活血。

益母草為唇形科植物益母草LeonurusjaponicasHoutt.的新鮮或干燥地上部分，具有活血調經、利水消腫等功效，臨床上常用于血滯經閉、痛經、水腫等病癥[4]，素有“婦科圣藥”的稱號。《本草蒙筌》中記載其“能總調胎產諸證，故加益母之名，具有去死胎，安生胎，行瘀血，生新血”的功效。現代藥理學研究表明[5]，益母草提取物具有抗炎鎮痛、抗氧化、抑菌等作用。此外，益母草提取物對子宮組織具有雙向調節作用，益母草0.5%鹽酸水溶液提取生物堿對小鼠離體子宮具有興奮作用，而益母草氯仿提取生物堿對離體子宮具有抑制作用[6]。益母草注射液中的水蘇堿對子宮的興奮作用，也可能與動物的種屬有關[7]。此外，益母草對產后子宮內膜具有止血修復作用，有利于產后子宮恢復[8]。

中藥具有多成分、多靶點、多途徑作用等特點，在整體上對疾病發揮著治療作用，但其物質基礎和作用機制研究薄弱，影響了中藥發展的現代化進程。網絡藥理學能整體地、系統地研究藥物與疾病之間的作用關系，能對藥效物質、作用靶點和通路進行初步的預測，是中藥研究新的方法和手段[9]。本文利用網絡藥理學研究方法，通過有效數據的挖掘，預測益母草治療產后腹痛潛在作用靶點及作用機制，并進一步基于藥物流產大鼠模型驗證益母草治療產后腹痛的作用機理，為益母草的臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料

1.1 數據庫

中草藥系統藥理學平臺(TCMSP)數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)藥物分子靶點預測平臺Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch)、Similarity ensemble approach(http://sea.bkslab.org/)；疾病靶點標準化數據庫Uniport(https://www.uniprot.org)；疾病數據庫GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)；功能蛋白聯系網絡數據庫STRING(http://string-db.org/cgi/input.pl)；GO富集分析、KEGG富集分析數據庫Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)、Cytoscape3.7.2(https://cytoscape.org/)；Rx644.0.0；Win10操作系統。

1.2 實驗動物

SD大鼠，雌性，8～9周齡，體重200～220 g；雄性，8～9周齡，體重250～300 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號scxk(川)2015—030。

1.3 藥物與試劑

益母草膏(批號20190308)，主要成分為益母草，貴州百靈企業集團制藥股份有限公司。一抗：PGF2αR(批號00563431)、MMP9(批號02376588)、TIMP1(批號02376588)、VEGFA(批號20334270)、VEGFR2(00233460)，艾博抗(上海)貿易有限公司。二抗：Polink-2plus?Polymer HRP Detection(批號20200411、20200528)，北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 儀器

Finesse E+型轉輪式切片機、Section Bath型攤片機、SHANDON Exce型包埋機(賽默飛世爾科技中國有限公司)；DM 3000型顯微鏡(Leica公司)；HH500-B1型烘箱(上海博尼化輕裝備有限公司)；HCY-260型4℃孵育箱(海爾股份有限公司)。

2 方法

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 挖掘益母草活性成分及其可能作用的靶點

以“yimucao”為關鍵詞，在TCMSP數據庫挖掘益母草中成分，再依據藥物代謝動力學(ADME-吸收、分布、代謝、排泄)原理，以生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-like，DL)為主要參照依據，設置OB≥30%，DL≥0.18篩選活性成分。此外，結合《中國藥典》和相關文獻，將不滿足上述篩選條件，但具有明顯藥理活性的化合物也納入研究。在TCMSP平臺，篩選出活性成分的相關靶點，最后利用Uniprot數據庫記錄Human的相關基因，轉換活性成分靶點為對應的Gene symbol；在Pubchem數據庫上找出化合物的Canonical SMILES，在Swiss Target Prediction和Similarity ensemble approach平臺上對化合物可能作用的靶點進行預測，并綜合TCMSP上靶點檢索結果，用作下一步分析。

2.1.2 挖掘疾病基因，與益母草活性成分的靶基因作交集處理，并繪制Venn圖

GeneCards疾病數據庫擁有廣泛的數據來源，整合了Drug bank等多家數據庫資源及文獻、實驗數據，是目前少數綜合性疾病數據庫之一。OMIM數據庫是人類基因和遺傳表型的全面、權威的綱要，每天更新，且可免費獲取。在GeneCards和OMIM數據庫上，以“postpartum abdominal pain”為關鍵詞，檢索疾病相關的基因。并將得到的疾病基因與活性成分的靶基因錄入，利用R軟件，繪制Venn圖，得到活性成分與疾病的交集靶點。

2.1.3 構建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件構建可視化“藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網絡，每個節點分別代表“藥物、活性成分、疾病、交集靶點”，直觀展示各節點之間的聯系。

2.1.4 構建蛋白-蛋白互作網絡(PPI網絡)

STRING是已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫。將藥物與疾病的交集靶點輸入STRING平臺，定義物種為人，構建益母草抗產后腹痛的蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI網絡)。最低互作評分(minimum required interaction score)設定為0.9。網絡中各節點度值代表該蛋白在相互作用中的地位，并用柱狀圖直觀表示前30名蛋白及節點連接數量，連接數量的大小可直接代表節點在網絡中的地位。

2.1.5 利用Cytoscape對PPI網絡進行拓撲分析

將STRING平臺篩選出來的相互作用的蛋白基因輸入Cytoscape軟件BisoGenet插件中，篩選條件為Identifiers下選擇“Homo sapiens(Human)”“Gene identifiers only”，Data Settings下只選擇“Protein Protein Interaction”，點擊“Tools-NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network”，得到第一張拓撲分析圖，數據以.csv格式導出，在excel表格中打開，計算“degree”值的2倍中位數，以此為篩選條件，得到第二張拓撲分析圖，然后打開Cytoscape軟件中CytoNCA插件，Centralities下除“degree(DC)”項不選擇以外，其余幾項均選擇“without weight”，將得到的數據以.csv格式導出，在excel表格中計算“degree”“betweenness”“clossness”三項的中位數，以此為篩選條件，得到第三張拓撲分析圖。

2.1.6 GO富集分析

使用R軟件和Bioconductor加載包，對上述拓撲分析得到的核心靶點進行GO富集分析中的生物過程(biological process，BP)分析，細胞組成(cellular component，CC)分析，分子功能(molecular function，MF)分析，并繪制相應的可視化圖片。

2.1.7 KEGG富集分析

將上述拓撲分析得到的核心靶點導入DAVID 6.8數據庫中，點擊“Functional Annotation”選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“gene list”，種屬選為“Homo sapiens”，之后選取“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。點擊“chart”，將數據復制到excel表格中，以由小到大且P≤0.01為篩選條件，選取符合條件的前20的KEGG通路，使用R軟件對其進行可視化處理。

2.2 實驗驗證

2.2.1 模型建立分組及給藥

雌性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、益母草膏組，除對照組大鼠以外，其余各組大鼠按文獻方法復制藥物流產大鼠模型[10]，每組6只，造模第二天益母草膏組大鼠灌胃給予益母草膏(3.6 g/kg，相當于臨床劑量的2倍)，對照組、模型組大鼠給予等量生理鹽水，連續7天，末次給藥后，禁食不禁水12 h，取大鼠子宮，置于4%多聚甲醛溶液中固定。

2.2.2 免疫組化法測PGF2αR、MMP9、TIMP1、VEGFA、VEGFR2蛋白表達

取約為3 mm大小的中段子宮組織，脫水和透明化處理，用石蠟包埋，做成蠟塊，用 Thermo切片機將組織切成4 mm厚的薄片，在溫水中將組織展平后撈在載玻片上，60 ℃烘烤切片2 h；對切片進行免疫組化染色、鏡檢。切片在高倍鏡視野下(200倍)，應用image pro plus 6.0圖像分析系統進行定量平均光密度分析，棕黃色部位為抗原陽性表達部位。

2.2.3 數據分析

3 結果

3.1 活性成分篩選

通過TCMSP平臺數據挖掘，以OB≥30%，與DL≥0.18為篩選條件，共得到8個成分。根據2020版《中國藥典》益母草項下含量測定要求，益母草堿和水蘇堿為益母草中主要成分。有文獻報道，益母草堿通過降低全血黏度、改善大鼠的血瘀狀態，通過縮短子宮出血時間、加強子宮收縮和復舊作用[11]；水蘇堿能減少米非司酮誘導的流產后子宮出血作用[12]。因此益母草堿和水蘇堿也納入下一步考察范圍。最后得到益母草中活性成分共10種，包括花生四烯酸、甘草素、山奈酚、槲皮素、益母草堿等，詳見表1。

表1 益母草活性成分Table 1 Active components of Yimucao

3.2 化合物靶點和疾病靶點的獲取

在PubChem數據庫中檢索益母草活性成分Canonical SMILES結構式，輸入Swiss Target Prediction和Similarity ensemble approach平臺，并結合TCMSP數據庫中靶點檢索結果，共檢索出601個靶點；接著以“postpartum abdominal pain”為關鍵詞，在OMIM和GeneCards平臺上共檢索出800個產后腹痛相關靶點。利用R軟件，對化合物靶點和疾病靶點繪制Veen圖，得到了144個化合物與疾病交集靶點(見圖1)。

圖1 化合物靶點和疾病靶點Veen圖Fig.1 Veen diagram of component targets and disease targets

3.3 “藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網絡繪制

使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病”調控網絡，共156個節點，457條邊。如圖2所示，外圈紅色部分表示144個疾病與活性成分的交集靶點，內圈紫色方塊表示的是10個活性成分，黃色圓圈表示的是藥物益母草，淡藍色菱形表示疾病“產后腹痛”。

圖2 “藥物-活性成分-靶點-疾病”調控網絡Fig.2 “Drug-active components-targets-disease”regulatory network

3.4 關鍵靶點蛋白互作網絡

將前面得到的144個交集靶點輸入STRING數據庫，將最低互作評分(minimum required interaction score)設定為0.9，得到一個118個節點、375條連線的PPI圖。如圖3A所示，利用R軟件對導出的數據繪圖，繪制連接數目處于前30名的柱狀圖。如圖3B所示，其中度值最高的是PIK3R1蛋白，是PI3K-Akt通路調控網絡中的重要靶點。MMP9、VEGFA等皆處于較靠前的位置，可能是益母草治療產后腹痛的重要作用靶點。

圖3 PPI網絡分析Fig.3 The PPI network analysis注：A：PPI網絡；B：PPI網絡核心節點。Note:A:The PPI network;B:PPI network core nodes.

3.5 PPI網絡拓撲分析

為進一步研究益母草治療產后腹痛的潛在作用機制，將上述PPI網絡篩選出來的靶點錄入Cytoscape軟件的BisoGenet插件中進行網絡分析，得到第一張有4 163個節點、100 338條邊的拓撲分析圖。然后以第一張拓撲分析圖中2倍“degree”中位數值為篩選條件，得到第二張有1 061個節點、45 805條邊的拓撲分析圖。最后打開Cytoscape軟件中CytoNCA插件，計算“degree”“betweenness”“closeness”三項的中位數值，并以此為篩選條件，得到第三張包含98個節點、2 060條邊的拓撲分析圖。分析過程如圖4所示。

圖4 PPI網絡拓撲分析Fig.4 PPI network topology analysis

3.6 GO富集分析

使用R軟件和Bioconductor加載包，對上述拓撲分析得到的98個核心靶點以P≤0.05為篩選條件進行GO富集分析，對前20項進行可視化。如圖5所示，GO生物過程(BP)部分共得到1 151個條目，主要包括固有凋亡信號通路、DNA代謝過程的調控、細胞內受體信號通路、DNA代謝過程的正向調控、對不正確的蛋白質的反應等過程；GO細胞組成(CC)分析共確定97個條目，主要表現在核染色、粘著斑、細胞基質連接部位、蛋白質-DNA復合物、泛素連接酶復合物等位置；GO分子功能(MF)分析根據確定122個條目，主要包括與泛素蛋白、泛素樣蛋白、類固醇激素受體、核受體、核激素受體結合等方面。

圖5 GO富集分析氣泡圖Fig.5 The GO enrichment analysis bubble diagram注：A：生物過程(BP)分析；B：細胞組成(CC)分析；C：分子功能(MF)分析。Note:A:biological process (BP)analysis;B:cell composition (CC)analysis;C:molecular function (MF)analysis.

3.7 KEGG富集分析

將上述拓撲分析得到的98個核心靶點導入DAVID 6.8數據庫中，以P≤0.01為篩選條件，得到41條相關通路，按照P值由小到大的順序，選取前20的KEGG通路，使用R軟件對其進行可視化處理。如圖6所示，除了與癌癥相關的通路外，雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路可能是益母草治療產后腹痛的主要作用途徑。

圖6 KEGG富集分析氣泡圖Fig.6 KEGG enrichment analysis bubble diagram

3.8 實驗驗證

結合PPI網絡核心節點分析結果和KEGG信號通路富集結果，我們選擇MMP9、TIMP1、VEGFA、VEGFR2蛋白表達水平進行驗證。此外，PGF2α能引起子宮平滑肌過度收縮，血管痙攣，造成子宮缺血、缺氧狀態而造成腹痛，因此也對PGF2αR蛋白表達水平進行驗證。如圖7所示，與對照組(control，Con)相比，模型組(model，Mod)大鼠子宮中PGF2αR、MMP9蛋白表達水平顯著升高；TIMP1、VEGFA、VEGFR2蛋白表達水平顯著降低。而經益母草治療干預后，益母草組(Yimuao，YMC)大鼠子宮組織中PGF2αR、MMP9蛋白表達水平相較于模型組顯著降低；同時TIMP1、VEGFR2蛋白表達水平相較于模型組顯著升高。

圖7 益母草對流產模型大鼠子宮蛋白表達的影響Fig.7 Effect of Yimucao on uterine protein expression in rats with abortion model注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

4 討論與結論

網絡藥理學能整體且系統地研究藥物與疾病的相互作用關系，能反應中藥多成分、多靶點、多途徑相互作用的特點，是研究藥物治療疾病作用機制的一種新方法和工具。益母草是一種常用的中藥材，具有活血化瘀、祛瘀生新的功效;研究表明，益母草提取物能啟動產后子宮內膜止血修復機制，緩解子宮痙攣。產后腹痛是由于產后子宮縮復作用引起的，中醫認為，產后腹痛是由于產后氣血運行不暢、瘀滯不通，或產后失血過多造成氣血兩虛所致[1]。本文采用網絡藥理學研究方法，對益母草治療產后腹痛的作用靶點及作用機制進行探討，得到益母草10個活性成分及其144個作用于產后腹痛靶點，免疫組化結果顯示益母草可顯著抑制模型大鼠子宮組織中PGF2αR、MMP9蛋白上調和TIMP1、VEGFR2蛋白下調，結合GO和KEGG富集結果，提示對雌激素、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1信號通路的調控作用可能是益母草治療產后腹痛的主要作用機理。網絡分析結果顯示，益母草治療產后腹痛可能的主要活性成分為槲皮素、山奈酚、花生四烯酸等。研究表明，槲皮素作可為雌激素受體調節劑，與雌激素受體(ER)結合，調控ER下游許多底物及信號通路[13]，參與調控子宮收縮，表現出對產后腹痛有調節作用。山奈酚是黃酮類化合物，具有多種生物活性，有研究表明[14]，山奈酚能顯著降低兔子動脈血中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、整合蛋白、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)等黏附分子的基因和蛋白水平，說明山奈酚能夠改善血管的瘀滯狀況。花生四烯酸既是炎癥反應的前體物質，也直接參與調節機體細胞內多種酶的活性和離子通道。作用于Ca2+通道，能直接調控Ca2+在細胞內的進出，進而影響組織的收縮與松弛，而子宮的縮復也依賴于子宮組織平滑肌細胞對Ca2+的調控，因此，山奈酚也對產后腹痛有調節作用。

蛋白互作網絡顯示，益母草中活性成分可能是通過PIK3R1、CXCL8、IL6、JUN、VEGFA、NFKB1、IL1B、MMP9等藥物與疾病共有靶點起作用。PIK3R1中文名為“磷脂酰肌醇3激酶”，其在胰島素的代謝作用中起著重要作用，該基因的突變與胰島素抵抗有關[15]。CXCL8即IL-8，是趨化因子中的一員，近年研究發現，其參與了哺乳動物整個生殖過程，也與某些生殖病理過程有關[16]。VEGFA即血管內皮生長因子A，可特異性地作用于內皮細胞，并具有多種作用，如增加血管通透性、誘導血管生成、誘導內皮細胞生長、促進細胞遷移等[17]。此外，PPI網絡拓撲分析結果顯示，多種凋亡抑制因子、細胞增殖因子等也參與了該過程，如CUL7、AKT1、TP53等。而產后腹痛的一大原因是產后子宮內膜損傷，造成大出血或惡露不絕，因此，止血損傷修復機制的啟動對治療產后腹痛尤為重要。

GO注釋結果提示，拓撲后的核心靶點主要參與固有凋亡信號通路、DNA代謝過程的調控、細胞內受體信號通路、DNA代謝過程的正向調控、對不正確的蛋白質的反應、DNA生物合成等生物學過程；定位在細胞核染色、粘著斑、細胞基質連接部位、蛋白質-DNA復合物、泛素連接酶復合物等位置；并與泛素蛋白、泛素樣蛋白、類固醇激素受體、核受體、核激素受體等結合。KEGG富集分析結果顯示，有41條通路可能參與了益母草度產后腹痛的調節，在靠前的20條通路中，除了與癌癥有關的通路以外，雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等涉及其中。PI3K-Akt信號通路在調控各種不同細胞功能，如代謝、生長、增殖、存活、轉錄以及蛋白質合成方面發揮重要作用[18]。MAPK存在多種亞族，其中ERK廣泛存在于多種組織中，高度參與細胞的增殖分化調控[19]。產后子宮是一個缺氧環境，能激活HIF-1信號通路，調控葡萄糖代謝、細胞增殖和血管形成[20]。

MMP9是基質金屬蛋白酶家族的一員，參與調節雌激素信號通路，在血管生成、細胞遷移和傷口愈合等生理過程發揮作用，在產后子宮復舊的過程中，能促進子宮血管生成和生長。TIMP1是基質金屬蛋白酶組織抑制因子家族的一員，是HIF-1信號通路下游效應分子，能和MMP9形成復合物而抑制MMP9的活性，在產后子宮生理病理過程中起重要作用[21]。VEGFA、VEGFR2是血管內皮生長因子的一員，參與子宮內膜血管重塑過程，在產后子宮復舊過程中起重要作用[22]。

產后腹痛的主要原因是產后子宮血瘀、強直收縮所致。子宮收縮時，引起血管缺血，組織缺氧，神經纖維受壓等而產生類似于痛經的疼痛。PGF2α過高能引起子宮平滑肌過度收縮，血管痙攣，造成子宮缺血、缺氧狀態而造成腹痛[23]。產后子宮組織處于一個損傷修復狀態，血瘀的產生可能與子宮修復過程中微循環障礙有關，即子宮內膜血管修復再生困難。因此，本研究通過米非司酮和米索前列醇制備藥物流產大鼠模型，該模型能使大鼠處于子宮出血和血瘀狀態，與產后腹痛的部分臨床癥狀相符合，用益母草膏進行干預，對子宮組織中PGF2αR、MMP9、TIMP1、VEGFA、VEGFR2的蛋白表達進行測定。研究結果表明，益母草可顯著抑制模型大鼠子宮組織中PGF2αR、MMP9蛋白上調和TIMP1、VEGFR2蛋白下調。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學，分析了益母草治療產后腹痛潛在的作用機制，結果指出益母草治療產后腹痛是通過多成分、多靶點、多途徑的方式發揮作用。通過進一步檢測益母草對流產模型大鼠子宮組織中相關蛋白表達水平的影響，驗證了部分網絡藥理學的結果，即PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路可能是益母草治療產后腹痛的主要作用途徑，為進一步研究益母草的藥效及其作用機理提供了可靠的參考。