姜黃素納米粒對人視網膜色素上皮細胞的示蹤研究

鄭海生，藍育青，李 芳，梁曉茜，楊鎮朵，鐘興武

0引言

姜黃素(curcumin，Cur)作為我國的一種傳統中藥，具有多種療效[1-3]。姜黃素在眼科的應用研究發現其具有抑制人視網膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，hRPE)細胞增殖及糖尿病大鼠視網膜血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達等作用，因此其在防治眼底新生血管性病變中可以發揮抗新生血管的藥理作用，并且已有臨床試驗研究姜黃素的藥物代謝動力學及癌癥治療的生物有效劑量[4-5]。但姜黃素難溶于水，體內被快速代謝，體內半衰期短，且需要長期、反復用藥。這給患者帶來許多的不便與痛苦。同時由于其作用于組織和細胞的非選擇性，且目前仍無穩定性較好的藥物劑型，影響了姜黃素在臨床上的廣泛應用。因此研制姜黃素的新劑型具有重要的臨床意義。納米中藥是指運用納米技術制造的、粒徑小于100nm 的中藥有效成分、有效部位、原藥及其復方制劑[6-7]。納米中藥與傳統中藥比較有其優勢[8-10]：增大了藥物的溶解度；更容易通過血-視網膜屏障、血-腦屏障定向作用于視網膜及中樞神經；具有緩釋性、靶向性；提高藥物的質量、減少副作用、提高療效；節約有限的中藥資源；利于中藥標準化、國際化等特點。本研究主要通過納米技術將姜黃素包載到脫氧膽酸基接枝的殼聚糖納米粒中，制備成載藥納米粒，希望此納米粒具有緩慢釋放藥物功能，降低姜黃素的不良反應，提高藥物的療效、長時間維持藥效濃度，減少多次給藥對患者帶來的痛苦。同時通過觀察比較姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒和姜黃素原藥對體外培養的hRPE細胞的作用，為尋找一種新型的、緩釋的、安全有效地防治眼底新生血管性疾病的新藥物提供初步的理論依據。

1材料和方法

1.1材料實驗細胞：hRPE細胞(中山大學附屬眼科中心醫院提供，選第3～6代細胞用于實驗)。主要試劑：姜黃素(購自SIGMA公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)。主要儀器設備：光學倒置顯微鏡(德國Leica MPS-30)、熒光顯微鏡Axioplan2 imaging(德國 Zeiss)。

1.2方法

1.2.1材料合成與制備

1.2.1.1姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的合成將殼聚糖-脫氧膽酸放于PBS6.2中(按4mg/mL)，不斷攪拌使殼聚糖-脫氧膽酸膨脹溶解；稱取一定量姜黃素并溶解于四氫呋喃中；然后緩慢滴加姜黃素的四氫呋喃溶液至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中，再緩慢滴加蒸餾水，繼續攪拌至少24h；在攪拌下升溫至40℃，使殘余的四氫呋喃揮發；最后在5 500轉下離心15min，下層沉淀為未負載的藥物，上清液即為殼聚糖-脫氧膽酸負載的姜黃素納米粒。

1.2.1.2異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的合成稱取殼聚糖-脫氧膽酸置于圓底燒瓶，滴加磷酸緩沖液(pH=6.2)，不斷攪拌使殼聚糖-脫氧膽酸溶解；取少量的熒光染料異硫氰酸熒光素溶于PBS6.2的緩沖液中，然后慢慢滴加至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中，再緩慢滴加少量水，水滴加完后，繼續攪拌至少24h；高速離心(20 000g，20min)分離，棄去上層液體，下層沉淀液為負載異硫氰酸熒光素的殼聚糖-脫氧膽酸納米粒；加磷酸緩沖液溶解沉淀，可得到異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒水溶液。

1.2.1.3異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的合成稱取殼聚糖-脫氧膽酸置于圓底燒瓶，滴加磷酸緩沖液，不斷攪拌使殼聚糖-脫氧膽酸溶解；稱取少量姜黃素并溶解于四氫呋喃中；然后緩慢滴加姜黃素的四氫呋喃溶液至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中，再取少量的異硫氰酸熒光素溶于PBS6.2的緩沖液中，然后慢慢滴加至殼聚糖-脫氧膽酸溶液中(避光)，繼續攪拌至少24h；在攪拌下升溫至40℃，使殘余的四氫呋喃揮發；5 500轉下離心15min，取上清液；高速離心(20 000g，20min)分離，棄去上層液體，下層沉淀液為負載異硫氰酸熒光素及姜黃素的殼聚糖-脫氧膽酸納米粒；加磷酸緩沖液溶解沉淀，可得到異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒水溶液。

1.2.1.4姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的體外釋放采用動態透析法考察姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒在含20%乙醇的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.2，緩沖液:乙醇=80∶20，v/v；乙醇作為藥物的增溶劑)的釋放特征。將3.8mL姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液(載藥量27.5%)裝入透析袋中，將透析袋放于196.2mL透析介質中(含20%乙醇的磷酸鹽緩沖液，37.0℃，100r/min)，每隔一段時間取透析介質溶液1.0mL，同時補充1.0mL介質溶液。采用紫外分光光度法(λ=433nm)測定藥物的釋放量，藥物釋放率=(藥物釋放量/藥物總量)×100%。

1.2.1.5透射電子顯微鏡觀察納米粒形態分別取少量殼聚糖-脫氧膽酸納米粒和姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液分別滴至銅網支持膜上，用濾紙將多余的液體吸除，待自然干燥后用2%磷鎢酸染色，晾干后在透射電鏡下觀察二者的形態。

1.2.2異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒及異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞的相互作用取對數生長期的hRPE細胞以1.0×105/cm2的密度接種于24孔板中，每孔500μL DMEM-F12培養基。培養24h后，細胞貼壁，更換新的培養基，分別加入異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸和異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液，使溶液中殼聚糖-脫氧膽酸的最終濃度為1.0mg/mL。CO2培養箱內避光培養1、3、5d后，棄去培養基，并用PBS溶液沖洗3次，加入新的培養基，然后在倒置熒光顯微鏡下進行觀察和照相。

2結果

2.1姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒合成及其載藥量及負載效率的測定所合成的姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液為淡黃色，并可見丁達爾(Tyndall)現象(圖1A、B)。

圖1 合成的姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液 A：合成的淡黃色姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒溶液；B：納米粒溶液的丁達爾(Tyndall)現象。

2.2姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒的體外釋放姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒在溶液中的釋放行為見圖2，藥物從納米粒中釋放96h后達到平衡，累積釋放藥物量為31.6%。

圖2 姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒的體外釋放。

2.3納米粒形態通過透射電子顯微鏡觀察可見未負載藥物的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒呈球形或類球形，大小均一，粒徑約30～50nm(圖3A)；負載姜黃素的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒粒徑明顯增大，約70～100nm(圖3B)。

圖3 殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒負載藥物前后的透射電鏡照片 A：未負載藥物的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒，粒徑約30～50nm；B：負載姜黃素的殼聚糖-脫氧膽酸納米微粒，載藥量27.5%，粒徑約70～100nm。

2.4異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒及異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞的相互作用

2.4.1異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞共培養24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察1、3、5d后納米粒與細胞相互作用的關系見圖4。

圖4 異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞的相互作用 A：作用1d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒大部分仍位于近細胞膜的部位(可能于細胞膜表面，或剛透過細胞膜進入細胞質中)；B：作用3d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒逐漸向細胞核聚集，大部分位于細胞核周圍；C：作用5d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒已進入細胞核，且殼聚糖-脫氧膽酸納米粒可能在細胞內溶酶體的作用下部分降解，可見熒光染料擴散到整個細胞中，在熒光圖中可看到細胞的輪廓，且細胞核區域的熒光較強。

2.4.2異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞共培養24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察1、3、5d后納米粒與細胞相互作用的關系見圖5。可見到此二者之間的相互關系與空載的殼聚糖-脫氧膽酸納米粒具有相似的過程。

圖5 異硫氰酸/姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞的相互作用 A：作用1d后，殼聚糖-脫氧膽酸納米粒大部分仍位于近細胞膜的部位(可能于細胞膜表面，或剛透過細胞膜進入細胞質中)；B：作用3d后，姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒逐漸向細胞核聚集，大部分位于細胞核周圍；C：作用5d后，姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒已進入細胞核。

3討論

高分子化合物是制備納米控釋系統的主要載體材料，常以天然的大分子體系和合成的可生物降解的聚合物體系為主。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，是至今為止唯一發現的帶陽離子性質的堿性氨基多糖。殼聚糖在自然界中廣泛存在于低等生物菌類、藻類的細胞，節支動物蝦、蟹、昆蟲的外殼等。殼聚糖具有較好的可降解性、生物相容性和黏附性[11]。殼聚糖包裹還可以提高脂質體的穩定性和適用性[12-13]。因此殼聚糖廣泛應用于食品、醫藥、保健、生物工程等領域[14]。遠在幾千年前《本草綱目》中早已有蟹殼粉的記錄，可見古人早已將殼聚糖作為醫療之用。在本研究中所合成的姜黃素/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒是選用了殼聚糖-脫氧膽酸為藥物載體，殼聚糖-脫氧膽酸是采用EDC作耦合劑，在殼聚糖上接枝脫氧膽酸，合成具有兩親性的改性殼聚糖，該聚合物在水溶液中可形成納米粒。納米藥物的緩釋機制一般認為有：(1)吸附或連接于粒子表面的藥物與納米粒脫離；(2)納米膠束內部的藥物不斷向外擴散；(3)納米膠束本身不斷被降解，藥物不斷地從膠束內被釋放出來。

本研究通過合成脫氧膽酸基接枝的殼聚糖衍生物負載姜黃素納米粒，并進行擴散釋放實驗法及利用熒光染料的示蹤作用，在倒置熒光顯微鏡下觀察異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞相互作用情況。實驗中發現藥物從納米粒中的釋放表現為突釋和緩釋兩個階段，藥物從納米粒中釋放96h后達到平衡，累積釋放藥物量為31.6%，其中前20h為突釋階段，藥物釋放達19.9%。體外擴散釋放實驗證明了本研究所合成的負載姜黃素納米粒具有緩慢釋放功能。倒置熒光顯微鏡下觀察異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞的作用發現，異硫氰酸/殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與細胞作用1d后，納米粒大部分仍位于近細胞膜的部位(可能在細胞膜表面，也可能在細胞質中)；作用3d后，納米粒逐漸向細胞核會聚，且大部分位于細胞核周圍；作用5d后，可看到納米微粒已進入細胞核，且在細胞內溶酶體的作用下納米微粒可能有部分降解，熒光染料擴散至整個細胞中，在熒光圖中可看到細胞的輪廓，且細胞核區域的熒光較強。即隨著時間的延長，納米微粒由細胞外進入細胞內并逐漸降解。在細胞與納米粒相互作用過程中，我們分析認為可能是殼聚糖含有帶正電的氨基基團，而細胞膜表面蛋白多糖帶負電。有研究顯示聚陽離子的納米粒可以通過納米粒表面的正電荷與細胞表面帶負電荷的蛋白多糖非特異性靜電結合被吞噬進入細胞[15]。另有研究發現由于姜黃素在納米粒中呈現緩釋趨勢增加了藥物的內吞作用[16]。因此，本研究中殼聚糖-脫氧膽酸納米粒可能通過電荷的相互作用而與細胞吸附，也可能是殼聚糖經過了脫氧膽酸改性，具有兩親性，而更易與細胞膜作用。然而，本研究僅觀察了殼聚糖-脫氧膽酸納米粒與hRPE細胞在不同時間內的相互作用關系，但這些作用與納米粒的粒徑大小、濃度之間的相互關系如何尚需進一步實驗證明。本研究為進一步耦聯特異性VEGF抗體制備靶向載藥納米粒及進行體內動物實驗提供了研究基礎，為尋找一種新型的、持久的、安全有效防治眼底新生血管性疾病的新藥物提供了初步的理論依據。