內皮-間質轉化在眼部疾病中的研究進展

孟志尚，吳文一，羅 靜

0引言

內皮-間質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)是在特定的病理或生理條件下，內皮細胞向間質細胞轉化或分化，并伴隨表型和功能改變的過程。具體表現為內皮細胞由鵝卵石樣外形轉為長梭形，失去特異標志物如VE-鈣黏蛋白(VE-cadherin)、Tie受體1/2(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 1/2, Tie-1/2)、血管內皮生長因子受體1/2(vascular endothelial growth factor receptor 1/2, VEGFR 1/2)、血小板-內皮細胞黏附分子-1/CD31(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1/cluster of differentiation 31, PECAM-1/CD31)等，轉而表達間質細胞特異性標志物，如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)等，并獲得較強的增殖和遷移能力[1](圖1)。作為上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的特殊形式，該現象最早在心血管系統胚胎發育中被發現[2]，亦是機體損傷修復的重要機制[3]。與EMT類似，EndoMT廣泛參與腫瘤侵襲及心、肺、腎、眼等器官纖維化疾病等病理過程[4-5]。越來越多的證據證實了EndoMT在眼部疾病中的重要作用，包括角膜病[6]、青光眼[7]、視網膜脈絡膜新生血管性疾病[8-9]等。本文針對EndoMT的基本生物學特征、發生機制及其在眼部疾病中的相關研究展開綜述。

圖1 EndoMT參與眼病模式圖 眼球插圖基于Servier Medical Art(http://smart.servier.com/)修改，并根據Creative Common Attribution 3.0許可使用(https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)。

1 EndoMT的基本生物學特征

胚胎發育過程中,EndoMT介導了視網膜血管的發育[10]。成體中正常表型的內皮細胞是維持機體正常功能的重要保障。包括腦毛細血管內皮細胞參與構成的血-腦屏障，眼中虹膜血管內皮細胞參與構成的血-房水屏障、視網膜血管內皮細胞參與構成的血-視網膜屏障等[11]。機體在創傷、藥物、感染等損傷因素作用下，抗損傷修復機制啟動，包括成纖維細胞激活、大量增殖，細胞外基質合成增多、沉積等[12]。但慢性炎癥等刺激因素可誘發病理性新生血管形成及成纖維細胞過度增殖，造成瘢痕、組織纖維化等不良后果，EndoMT在其中扮演了重要的角色[13]，且其在一定時間及條件范圍內具備可逆性[14]。所以，研究EndoMT的發生機制，探究其中的關鍵分子和涉及的信號通路，尋求潛在的治療靶點，具有重要的臨床意義。

2 EndoMT的發生機制

EndoMT發生機制復雜，涉及多種分子和通路的交互作用，目前研究多聚焦于轉化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)家族關鍵分子和通路的作用及相應抑制劑的運用方面。

TGF-β是誘導EndoMT發生的關鍵因子，TGF-β的3種亞型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均參與EndoMT[15]。其中，TGF-β2被認為是最有效的激活劑，TGF-β1和TGF-β3誘導的EndoMT亦需TGF-β2介導，且運用siRNA沉默TGF-β2基因表達可減弱經TGF-β1和TGF-β3處理的細胞中EndoMT標志物的表達[16]。TGF-β/Smad以及非Smad依賴的非經典型途徑均參與EndoMT過程(圖2)，經典Smad途徑中，TGF-β與膜受體結合活化后，Smad2/Smad3磷酸化，繼而結合Smad4，在細胞核內發揮調控EndoMT相關基因表達的作用，Smad7是其中重要的負性調控因子[17]。多條非Smad依賴性通路也參與EndoMT的發生，TGF-β可通過MAPK家族(包括ERK、JNK、p38 MAPK)、PI3K/Akt/mTOR、Rho/ROCK、Rac、c-Abl、PKC和NF-κB等下游通路參與EndoMT[18]。另外，TGF-β途徑與Wnt、Notch等通路可能存在交互作用，如Notch配體Jagged-1是Wnt/TCF的靶基因[19]。通過上述途徑，內皮特異性基因轉錄減少或由EndMT相關轉錄因子(如Snail、Slug、Twist、Zeb等)介導的間質特異性基因轉錄增加，作為靶蛋白的內皮特異標志物表達相應減少,內皮細胞結構改變，獲得間質細胞表型，也即產生EndoMT[20]。細胞因子在EndoMT中也發揮了直接或間接作用，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-13等可通過IRAK的介導激活NF-κB而參與EndoMT，IL-13誘導的EndoMT中還涉及了STAT6、AKT分子級聯反應等過程[3]。隨著表觀遺傳學、多組學研究等領域的發展，有關非編碼RNA在EndoMT中的調控網絡也逐步被揭開[18,21]。

圖2 TGF-β通路參與EndoMT示意圖。

3 EndoMT與眼部疾病

3.1角膜病正常數量和質量的角膜內皮細胞通過主動泵機制，維持角膜透明性。角膜內皮損傷較小時可由附近的正常細胞遷移修復，而在內眼手術損傷、角膜基質和前房持續炎癥等因素刺激作用下，EndoMT參與的纖維化及細胞外基質可沉積于角膜內皮層與后彈力層之間，形成角膜后膜[22]。在Fuchs角膜內皮營養不良、后部多型性角膜內皮營養不良、梅毒性角膜基質炎患者中均發現角膜內皮細胞向間質轉化的表現，如細胞梭形改變，α-SMA、波形蛋白、FSP-1、I型和Ⅲ型膠原表達陽性等[23-24]，且Zeb1突變與遲發型Fuchs角膜內皮營養不良、后部多型性角膜內皮營養不良相關[25]。人離體角膜細胞模型中，堿性成纖維細胞生長因子可上調Snail1/2、Zeb1/2而誘導EndoMT，且隨傳代培養程度加重[26]。核p120連環蛋白可調節Rho/ROCK，控制接觸抑制狀態的角膜內皮細胞增殖，轉入p120 siRNA可激活p-120連環蛋白-kaiso信號傳導途徑，抑制EndoMT而不影響正常細胞增生[6]，運用ROCK抑制劑也可有效改善角膜內皮細胞的細胞形態、細胞間連接及轉運蛋白表達[27]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族激活Wnt信號通路，由成纖維細胞產生的外泌體介導，使離體角膜內皮表現出間質特征，MMP抑制劑可逆轉這一過程[28]。在轉入Smad7基因的大鼠角膜堿燒傷模型中，Smad2被阻斷從而抑制EndoMT，而正常的創傷修復過程不受影響[22]。上述多維度的研究結果展現出EndoMT相關分子作為角膜纖維化疾病治療靶點的廣泛前景，揭示其中精密復雜的調控機制可能是未來研究的方向。

嚴重角膜內皮失代償者需角膜移植，Naranjo等[23]研究發現在一部分后彈力層剝離角膜內皮移植(DSAKE)術后病例中，組織病理切片可見后彈力層與內皮層間存在纖維膜樣組織，其中可發現長梭形細胞及間質細胞標志物α-SMA、波形蛋白表達陽性，可能是由角膜內皮細胞經EndoMT機制轉化形成成纖維樣細胞，分泌非正常的細胞外基質形成角膜后膜，造成角膜混濁，嚴重者最終導致移植失敗。角膜供體不足也是困擾角膜移植領域的難題，研究再生醫學工程EndoMT作用的重要性不言而喻，探索EndoMT在離體角膜細胞培養中的相關機制可能是再生醫學領域中的潛在突破點。

3.2青光眼小梁網和Schlemm管的病理性纖維化會使房水流出通道受阻，參與青光眼的病理生理過程。Ashok等[7]研究發現，小梁細胞的EndoMT參與原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)，正常構象的朊病毒蛋白(prion protein, PrPC)是正常基因編碼的產物，小梁細胞和Schlemm管內皮細胞表達的PrPC具有抗氧化及維持細胞外基質平衡的重要生理功能，其缺失或功能障礙會激活Rho/ROCK通路，致使小梁細胞EndoMT,發生病理性纖維化而增加房水流出阻力。此外，TGF-β2處理體外培養的Schlemm管內皮細胞可出現失去CD31、VE-鈣黏蛋白等標志，轉而表達α-SMA、Ⅰ型和Ⅳ型膠原等一系列EndoMT的特征性轉變[29]。除EndoMT外，EMT參與了青光眼中濾過手術后瘢痕化、視神經受損纖維化等病理過程[3]，展現出其在青光眼發生及術后纖維化全過程中發揮的重要作用，為青光眼全程管理提供了新見解。

3.3視網膜脈絡膜疾病正常血管的生長和成熟是一個多種生長因子及抑制因子平衡控制，既涉及組織的自然發育，也涉及新生血管性疾病病理過程[30-31]。血管新生與纖維增殖是視網膜脈絡膜疾病重要的研究方向，內皮細胞的增殖遷移是其中的重要環節，探究其涉及的調控機制及潛在治療策略有重要的臨床意義。

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者終末器官損害的眼部表現[32]。抗VEGF治療糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)中可能出現的纖維化加重，增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)中纖維增殖膜等造成牽拉性視網膜脫離，加大手術難度等都是臨床亟待解決的關鍵問題。多項研究表明，EndoMT不但參與了上述纖維化過程，更貫穿了DR發生發展的始終[9,33]。高糖可誘導血管內皮細胞發生EndoMT,血管緊張素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ)是參與的介質之一[34]。晚期糖基化終末產物也被證實可誘導視網膜血管內皮細胞發生EndoMT,AKT2信號通路是此過程的關鍵要素[35]。神經損傷動物模型中，血管內皮細胞可通過自噬-溶酶體途徑吞噬清除受損的髓鞘，誘導炎癥、血管生成和以EndoMT為基礎的纖維修復等序貫事件，揭示了EndoMT在DR神經病變中發揮的重要作用[36]。在PDR患者的纖維增殖膜中發現，血管內皮細胞經EndoMT機制轉化為活化的成纖維細胞，表達α-SMA、FSP-1等EndoMT的特異標志物[37]，并且已經發生轉化的細胞可以發揮抑制新生血管生成的作用[33]，這一發現可能為DR的血管新生與纖維化之間的“蹺板”平衡理論提供了新的證據[38]。現有一些處于臨床試驗中抗DME新生血管的“雙抗”藥物已取得較為滿意的實驗結果[39]，提示針對EndoMT相關的纖維化和抗新生血管形成的聯合療法，可能是未來治療DR的合理趨勢。

早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)是致嬰幼兒失明的常見視網膜血管性疾病，其致盲的主要原因是新生血管增生牽拉形成的牽拉性視網膜脫離和(或)異常血管滲漏導致的滲出性視網膜脫離[40]。ROP患兒的抗血管內皮生成因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療目前仍不在該藥常見治療疾病范圍內，其安全性、對正常發育的影響、加重纖維增殖等仍然是臨床難題。研究發現，在ROP小鼠模型中，缺血缺氧條件可能促使內皮細胞從現有血管床分離，經EndoMT機制增殖，進一步克隆擴增，參與病理性新生血管的形成[41]。雖然其具體過程仍需進一步研究，但也為ROP治療提供了切入點。

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是中老年人視力喪失的主要病因[42]。根據病理特征可分干性和濕性，后者以脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)為主要特征。病患人群中濕性ARMD更多且視力危害更嚴重[43]。盡管抗VEGF藥物已經成為濕性ARMD的標準治療藥物，但存在長期使用療效降低導致視網膜下纖維化和瘢痕形成及地圖樣萎縮使病情加重等問題。脈絡膜和視網膜血管內皮細胞的EndoMT機制參與了視網膜下新生血管改建、損傷愈合及纖維病灶的形成[8]。轉錄因子Snail1在促進包括CNV在內的眼部新生血管性疾病早期階段起著重要的作用。RNA-seq結果分析表明，敲除Snail1基因減少了控制細胞骨架排列和細胞外基質重塑的基因表達，行玻璃體腔內注射Snail1 siRNA抑制了CNV小鼠模型中新生血管的形成[44]。Rossato等[45]研究發現，EndoMT還可能是CNV抗VEGF治療耐藥的原因，抗VEGF藥物可誘導人視網膜血管內皮細胞(human retina endothelial cell, HRECs)發生EndoMT病理改變，抑制EndoMT后可明顯提高HRECs對抗VEGF藥物的反應，在CNV的小鼠模型中聯合使用抗VEGF及抗EndoMT藥物可明顯抑制新生血管的形成，為眼科新生血管疾病的研究及聯合治療提供了新思路。

4結語與展望

綜上所述，EndoMT在人體生理功能和疾病進程中都發揮了重要的作用，相關靶向治療藥物已在心、肺、腎等器官或系統性纖維化疾病中作為臨床治療選擇。眼部疾病自身承載的視覺器官具有精準細微等特點，需要更科學更完善的理論和實驗研究。通過尋找早期可靠的EndoMT相關生物標志物，針對下游病理性靶標精準治療的同時，又不影響正常損傷修復相關的信號通路，為基礎研究及臨床工作提供依據。