原發(fā)性急性閉角型青光眼患者房水中IL-8和IL-12p70的表達及其臨床意義

樊 芳，李科軍，閔 思，馬清敏，趙智華，王 玲，賈志旸

0引言

原發(fā)性閉角型青光眼是由于原發(fā)性房角關(guān)閉造成的眼壓急性或者慢性升高，從而引起眼部損傷的一組疾病。急性閉角型青光眼(acute angle-closure glaucoma，AACG)是原發(fā)性閉角型青光眼的一種常見類型，由于房角在短時間內(nèi)大范圍關(guān)閉，眼壓急劇升高，導(dǎo)致眼痛、視力下降、頭痛、惡心、嘔吐等典型的臨床表現(xiàn)，對眼部組織的損傷極大。房水循環(huán)平衡狀態(tài)的破壞是導(dǎo)致該病的主要原因。房水在眼內(nèi)循環(huán)流動，一定程度上能反映眼內(nèi)微環(huán)境的變化。目前針對房水細胞因子濃度測定的研究廣泛開展，而且部分已經(jīng)應(yīng)用于臨床。房水中IL-6、IL-10的濃度和比值可用于輔助診斷眼內(nèi)淋巴瘤[1]；房水中IL-6、IL-8的濃度水平可以預(yù)測眼內(nèi)炎[2]。AACG急性發(fā)作時，除了眼壓驟然升高，房水的成分是否發(fā)生了改變，通過對房水中細胞因子濃度的檢測分析，是否可以反映疾病的嚴重程度？是否可以預(yù)測疾病的預(yù)后？是值得探討的問題。在AACG急性發(fā)作的過程中，局部炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致眼部損傷的因素之一，同時免疫反應(yīng)在青光眼引起視神經(jīng)損傷的過程中發(fā)揮著一定作用，因此本研究對房水中炎癥相關(guān)因子IL-8和免疫相關(guān)因子IL-12p70的濃度進行評估，探討炎癥和免疫在疾病進展中的作用。

1對象和方法

1.1對象選取2019-10/2020-12于河北省人民醫(yī)院眼科住院治療的AACG急性發(fā)作的患者29例29眼作為研究組(AACG組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于18周歲；(2)符合AACG的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)AACG首次發(fā)作。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)各種原因?qū)е碌睦^發(fā)性青光眼；(2)眼部合并有除外年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)的其他疾病，如眼部外傷、眼部腫瘤、黃斑病變、視網(wǎng)膜病變等；(3)既往眼部手術(shù)及外傷史；(4)合并有全身感染性、自身免疫性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)退行性疾病；(5)前房穿刺后樣本保存不符合要求。所有AACG患者均為藥物不能控制的急性發(fā)作期患者，行前房穿刺降低眼壓治療，后續(xù)根據(jù)白內(nèi)障及房角的情況進一步行激光周邊虹膜切開術(shù)、小梁切除術(shù)、白內(nèi)障聯(lián)合房角分離、白內(nèi)障聯(lián)合小梁切除術(shù)，根據(jù)是否行濾過性手術(shù)，進一步分為濾過性手術(shù)組(20例20眼)和非濾過性手術(shù)組(9例9眼)。選取同期住院行白內(nèi)障手術(shù)治療的ARC患者17例17眼作為對照組(ARC組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)青光眼病史；(2)合并其他眼部疾病；(3)既往眼部手術(shù)病史；(4)合并全身感染性、自身免疫性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)退行性疾病等。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(No.2017176)，遵循《赫爾辛基宣言》的原則，詳細告知受試者研究目的、研究方案、相關(guān)風(fēng)險及注意事項，入組前均自愿簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1一般資料采集所有受試者術(shù)前均進行詳細的眼部評估，包括最佳矯正視力、裂隙燈、眼底鏡、Goldman眼壓、房角鏡、超聲生物顯微鏡及A/B超等檢查。同時收集AACG患者的一般資料、急性發(fā)作持續(xù)時間(出現(xiàn)癥狀到前房穿刺實施前的時間)進行相關(guān)性分析。

1.2.2房水采集方法通過前房穿刺獲得50～100μL房水。(1)AACG組：房水采集于眼科檢查室內(nèi)完成，操作過程嚴格遵循無菌原則。眼部表面麻醉后，用生理鹽水行患眼淚道及結(jié)膜囊沖洗，排除內(nèi)眼操作禁忌證，對患者的眼瞼及睫毛根部行消毒，結(jié)膜囊應(yīng)用0.5%聚維酮碘溶液沖洗30s，再次用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊。在裂隙燈顯微鏡下行前房穿刺。用29G胰島素注射器于患眼顳側(cè)下方4∶00～5∶00位角膜緣內(nèi)1.0mm處，平行于虹膜穿入前房，在壓力的影響下房水會自動流入注射器，注意觀察房水的流出速度及流出量。為了防止虹膜脫出及嵌頓，盡量保證注射器斜面朝向角膜。穿刺結(jié)束立即將標(biāo)本注入無菌凍存管中并編號，置于含冰袋的保溫箱中，儲存于-80℃冰箱，并于1mo內(nèi)完成檢測。術(shù)眼點抗生素類滴眼液預(yù)防感染。(2)ARC組：術(shù)前1d于眼科治療室完成淚道及結(jié)膜囊沖洗。于白內(nèi)障手術(shù)當(dāng)天進行房水采集，采集時嚴格遵循無菌原則。待患者眼球表面麻醉后，按照內(nèi)眼手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進行手術(shù)眼的消毒鋪巾；結(jié)膜囊內(nèi)應(yīng)用0.5%聚維酮碘溶液沖洗30s，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，用29G胰島素注射器由擬行角膜輔助切口的位置穿刺入前房，抽取房水50～100μL；立即將樣本注入無菌凍存管中并編號，置于含冰袋的保溫箱中，儲存于-80℃冰箱，并于1mo內(nèi)完成檢測。

1.2.3細胞因子檢測采用流式液相蛋白定量技術(shù)進行房水中IL-8、IL-12p70的檢測。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別重懸IL-8和IL-12p70的兩種捕獲微球，捕獲微球與捕獲微球液以1∶1∶23的比例稀釋，然后加入25μL房水樣本，其余步驟參照CBA檢測試劑盒說明書(美國BD公司)進行操作。

統(tǒng)計學(xué)分析：使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0行數(shù)據(jù)分析。對于符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料則采用M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗，如果存在理論頻數(shù)小于5的單元格，則采用Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般資料本研究收集房水樣本46例46眼，AACG組29例29眼，其中男8例(28%)，女21例(72%)，年齡56～84(平均69.97±7.05)歲，右眼16眼(55%)，左眼13眼(45%)；ARC組17例17眼，其中男5例(29%)，女12例(71%)，年齡52～84(平均71.59±8.97)歲，右眼8眼(47%)，左眼9眼(53%)。兩組患者性別、眼別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.018，P=0.894；χ2=0.283，P=0.595；t=-0.681，P=0.500)。

2.2房水中細胞因子的表達情況AACG組患者房水中IL-8濃度[110.60(14.35，861.95)pg/mL]顯著高于ARC組[1.60(1.05，2.20)pg/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-5.384，P<0.001)；AACG組患者房水中IL-12p70濃度與ARC組相比[0.90(0.60，1.35)pg/mLvs0.70(0.50，0.95)pg/mL]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.587，P=0.112)，見圖1。

圖1 AACG和ARC患者房水中細胞因子表達情況 A：IL-8表達情況；B：IL-12p70表達情況。

2.3AACG患者房水中細胞因子濃度與一般資料的相關(guān)性本研究納入的AACG患者年齡56～84(平均69.97±7.05)歲、眼壓30.1～73.0(平均55.49±10.22)mmHg、眼軸長度21.08～23.10(平均22.17±0.57)mm。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AACG患者房水中IL-8濃度與急性發(fā)作持續(xù)時間呈正相關(guān)(rs=0.387，P=0.038)；IL-12p70濃度與急性發(fā)作持續(xù)時間無明顯相關(guān)性(rs=0.245，P=0.199)；兩種細胞因子濃度與患者年齡、眼壓、眼軸長度均無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。此外，AACG患者房水中IL-8與IL-12p70濃度亦無明顯相關(guān)性(rs=-0.075，P=0.699)。

表1 AACG患者房水細胞因子濃度與一般資料的相關(guān)性

2.4不同手術(shù)方式AACG患者的情況比較非濾過性手術(shù)組患者20例，其中男4例(20%)，女16例(80%)，平均年齡69.40±7.28歲，平均穿刺前眼壓56.89±10.38mmHg，平均眼軸長度22.41±1.02mm；濾過性手術(shù)組患者9例，其中男4例(44%)，女5例(56%)，平均年齡71.22±6.74歲，平均穿刺前眼壓52.39±9.67mmHg，平均眼軸長度22.20±0.41mm。兩組患者性別、眼別、年齡、眼壓和眼軸長度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但濾過性手術(shù)組患者急性發(fā)作持續(xù)時間長于非濾過性手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；濾過性手術(shù)組患者房水中細胞因子IL-8、IL-12p70濃度顯著高于非濾過性手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表 2。

表2 不同手術(shù)方式AACG患者的情況比較

3討論

房水自睫狀體產(chǎn)生后，循環(huán)流動于前后房之間，并參與眼部代謝活動。因此，房水細胞因子濃度在多種眼部疾病中都會發(fā)生改變。青光眼的發(fā)病及進展機制目前仍不明了，研究表明，眼壓、缺血缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等均參與青光眼的發(fā)生發(fā)展[3-5]。本研究采用液相蛋白定量技術(shù)對比分析AACG患者與ARC患者房水中IL-8及IL-12p70濃度，對可能反映AACG病程及疾病嚴重程度的細胞因子進行分析，以期為青光眼的疾病進展機制提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，AACG急性發(fā)作期患者房水中IL-8濃度增加，且與急性發(fā)作持續(xù)時間呈正相關(guān)，在濾過性手術(shù)組患者房水中濃度更高。IL-8是一種促炎性細胞因子，可以通過促進炎性細胞浸潤和免疫細胞趨化作用介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。由此推測AACG急性發(fā)作期患者房水中IL-8濃度明顯增加是導(dǎo)致AACG劇烈眼部炎癥反應(yīng)的一個重要誘導(dǎo)因素。這與Huang等[6]在AACG的房水炎癥相關(guān)因子研究中所證實的包括IL-8在內(nèi)的多種炎癥相關(guān)因子濃度增加的結(jié)論一致。IL-8也是一種神經(jīng)毒素，過量的IL-8可能導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細胞死亡和軸突損傷[7]。以往眾多研究證實了IL-8在青光眼的進展過程中起到了一定作用，IL-8在原發(fā)性開角型青光眼患者房水中表達增加[8]，同時也可以作為重要生物標(biāo)志物，預(yù)測開角型青光眼和新生血管性青光眼的手術(shù)預(yù)后[9-10]。而在慢性閉角型青光眼患者的房水檢查中，IL-8也明顯升高[11-12]。同時研究顯示，血清中IL-8水平與絕經(jīng)后女性原發(fā)性閉角型青光眼的視野進展有顯著相關(guān)性[13]。與既往研究類似，本研究結(jié)果也提示房水IL-8的水平與高眼壓持續(xù)時間有明顯的相關(guān)性，分析其原因可能是在AACG急性發(fā)作的持續(xù)高眼壓狀態(tài)下，眼部組織出現(xiàn)缺血缺氧，而缺血缺氧是誘導(dǎo)IL-8表達增加的主要因素[14]，隨著高眼壓持續(xù)時間的延長，組織缺血缺氧進一步加重，從而導(dǎo)致IL-8濃度進一步升高的惡性循環(huán)。這種高濃度IL-8對視神經(jīng)的毒性作用，在高眼壓持續(xù)狀態(tài)的患者是否協(xié)同眼壓一起對視神經(jīng)造成了損傷，需要進一步研究證實。此外，本研究結(jié)果顯示IL-8在濾過性手術(shù)組患者房水中表達水平更高，提示IL-8的濃度水平可能會作為評價AACG預(yù)后的一種細胞因子。與以往研究[6]不同，本研究結(jié)果提示IL-8與眼壓升高的程度并無明顯相關(guān)性，這可能是由于本研究納入的均為藥物不能控制的持續(xù)高眼壓狀態(tài)的患者，眼壓水平均較高，患者選擇的差異性是得出與之前研究不同結(jié)果的原因，但仍然需要進一步擴大樣本量研究證實。

免疫在青光眼的發(fā)生和發(fā)展過程中起著保護和損傷的雙重作用，隨著疾病的進展，AACG患者也會出現(xiàn)視神經(jīng)損傷。除高眼壓、缺血等因素外，免疫因素是否也參與了視神經(jīng)損傷的進程，目前尚無定論。IL-12是由IL-12p35和IL-12p40兩個亞單位組成，二者結(jié)合到一起則形成IL-12p70，IL-12p70作為IL-12的活化狀態(tài)，是免疫反應(yīng)十分強效的促化劑。研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性疾病如銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫性疾病中IL-12p70表達增加，并已經(jīng)作為治療的靶位應(yīng)用于臨床[15-16]。在與免疫功能關(guān)系密切的眼部疾病如葡萄膜炎和糖尿病視網(wǎng)膜病變患者房水中IL-12p70表達亦增加，并可以反映疾病的嚴重程度[17-18]。與青光眼相關(guān)的研究結(jié)果提示，原發(fā)性開角型青光眼和正常眼壓青光眼患者血清中IL-12濃度降低，并且濃度水平與患者視神經(jīng)損傷程度有明顯的相關(guān)性[19-21]。與血清學(xué)檢測不同，在青光眼患者房水的檢查中，IL-12濃度則表現(xiàn)出上升的趨勢，研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性開角型青光眼患者房水中IL-12濃度明顯升高，且既往有抗青光眼手術(shù)史的患者房水中IL-12濃度更高[22-24]。Sturge-Weber綜合征繼發(fā)的青光眼患者房水中可以發(fā)現(xiàn)IL-12p40濃度增加，且與年齡呈負相關(guān)[25]。但慢性閉角型青光眼患者房水中IL-12濃度則無明顯變化[22]。本研究結(jié)果顯示，與ARC患者相比，AACG患者房水中IL-12p70濃度無顯著差異，但是進一步的亞組分析發(fā)現(xiàn)，濾過性手術(shù)組患者房水中IL-12p70的濃度較非濾過性手術(shù)組顯著升高。推測其原因可能是由于濾過性手術(shù)組較非濾過性手術(shù)組的急性發(fā)作持續(xù)時間更長(P<0.05)，隨著發(fā)病時間的延長，疾病進一步進展，免疫相關(guān)細胞因子IL-12p70濃度升高，并發(fā)揮相關(guān)作用。這一結(jié)果也提示，免疫因素可能在AACG的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用，而IL-12p70是否可以作為判斷疾病嚴重程度的生物學(xué)標(biāo)記，這仍然需要進一步擴大研究樣本量證實。

綜上所述，與單純ARC患者相比，AACG患者房水中的炎癥因子IL-8水平明顯升高，隨著疾病的進展，免疫相關(guān)因子IL-12p70濃度也出現(xiàn)了差異性表達增加。炎癥和免疫可能參與了AACG的發(fā)病過程，但這些細胞因子是否可以作為控制病情的干預(yù)靶位仍然需要進一步研究。