兩種轉基因大豆基因組DNA提取方法的比較

武林琳

（山西農業大學棉花研究所 山西 運城 044000）

隨著社會經濟水平發展，國民對自身健康高度重視，這使得對蛋白質營養的需求直線增加。肉、蛋、奶、豆是蛋白質的主要來源，其中豆類因價格低廉、營養豐富廣受關注。在豆類中，大豆蛋白質豐富，且含有不飽和脂肪和多種人體必需的營養物質，成為人們研究的重點。近年來，大豆制品因為營養價值豐富、不含肉類中的膽固醇、生產成本低廉，已成為公認的最理想的蛋白質營養物質。營養學家亦認為豆制品既可滿足人們的營養需求，又可預防營養過剩，因此研究者們預言21世紀將是“大豆世紀”。

為提高大豆產量，科研工作者將基因工程技術和分子輔助育種技術相結合，目前已培育出一些高產、優質的大豆品種，即轉基因大豆。轉基因大豆高產、價廉、抗逆性強，因而被迅速推廣使用。轉基因大豆在大面積商品化過程中帶來了巨大經濟效益、社會效益與環境效益，但同時也產生了許多問題[1～3]。我國自1995年起，大豆由凈出口變為凈進口，且進口量逐年增加[4]。自耐除草劑的轉基因大豆于20世紀末被進口后，越來越多的轉基因大豆相關產品逐漸進入人們生活。加強對轉基因大豆的檢測，對發展我國大豆產業具有重要意義，而首要任務是建立有效的檢測大豆轉基因成分的方法[5]。

目前常用的轉基因成分檢測方法根據其檢測成分不同劃分為檢測蛋白質、酶和核酸的方法。不同的成分檢測方法及效率各不相同。PCR技術用于檢測核酸，是針對基因的一種檢測技術，對轉基因成分的檢測具有極強的針對性。此外，PCR技術又因其靈敏度高、快速、高效等特點，成為目前檢測轉基因植物成分最常用的技術之一。PCR檢測結果可重復性強，具有較高的可靠性和適應性。核酸是生物的遺傳物質，通過轉錄、翻譯、修飾等生物學過程決定生物的生長、遺傳、變異等。因此，在DNA水平對轉基因大豆進行檢測，意義重大。

本文用CTAB法和SDS法分別對轉基因大豆幼嫩葉片DNA進行分離純化：首先使用去污劑破裂細胞膜和細胞核核膜，之后將蛋白質和多糖沉淀去除，最后沉淀純化DNA[6]，然后再用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，以期研究出適合提取大豆DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料。轉基因大豆幼嫩葉片。

1.1.2 試劑。液氮、CTAB、SDS、Tris Cl(pH值8.0)、EDTA(pH值8.0)、NaCl、酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、沉淀DNA、NaAc、巰基乙醇、超純水或TE溶液。

1.1.3 儀器與設備。研缽、恒溫水浴、離心機、離心管。

1.2 樣品基因組DNA的提取及純化方法

1.2.1 CTAB法提取轉基因大豆DNA。①將1.0 g葉片放于含有液氮的研缽中研磨成粉末，將研磨后的粉末移入1.5 ml離心管后加入600μl CTAB溶液(預先加0.2%的巰基乙醇，預熱至65℃)；②將上述離心管移入65℃水浴鍋中，1 h后使用低溫高速離心機離心15 min(12 000 rpm，4℃)；③冷卻后，加入600μl的酚∶氯仿∶異戊醇(300∶288∶12)混勻，用12 000 rpm離心機在4℃下離心15 min；④吸取上清液，將其轉入一新的離心管，加入600μl氯仿∶異戊醇(576∶24)，低溫高速離心15 min(12 000 rpm，4℃)；⑤將上清液轉移至新的離心管中，加入3 mol/L NaAc(1/3體積)充分沉淀DNA；⑥在離心管中加入1 ml的-20℃預冷的無水乙醇，充分混勻后將離心管置于-20℃中3～4 h(或在-80℃環境放置30 min)；⑦將上述離心管12 000 rpm離心10 min，丟棄上清液后加入75%乙醇洗滌3次，將離心管中物質倒入吸水紙上晾干；⑧加入雙蒸水(10～20μl)溶解。

1.2.2 SDS法提取基因組DNA。①將1.0 g葉片放于含有液氮的研缽中研磨成粉末，將研磨后的粉末移入1.5 ml離心管；②依次向離心管中加入10 ml提取緩沖液、0.7 ml的20%SDS，充分混勻后置于60℃中30 min，整個過程不斷晃動；③待離心管中的物質冷卻至室溫后，使用8 000 rpm離心5 min，吸取1 ml上清液轉移至新的離心管中，根據說明加入各種試劑，使用氯仿代替苯酚，提取DNA；④最后加入0.2 TE緩沖液100μl溶解DNA。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳方法。使用瓊脂糖凝膠通過電泳技術將核酸根據大小和構象分離開，進而進行核酸分析。瓊脂糖凝膠電泳技術廣泛用于農業科學領域，在生物化學和分子生物學中具有重要作用[8～11]。瓊脂糖是從海洋生物瓊脂中提取的經糖基化修飾后的產物，是聚合鏈線性分子，在電泳過程中發揮分子篩功能，可將不同大小和構象的核酸分子分離開，達到分離核酸的目的[12～14]。具體操作過程如下：①根據說明書配制1%的瓊脂糖凝膠，加入EB染料。EB是一種高度靈敏的熒光染色劑，可以與核酸形成絡合物，在紫外光的激發下產生橘黃色的熒光，以便后期進行DNA的觀察；②將2μl的DNA溶液與1μl的6×Loading Buffer混合后點樣。Loading Buffer中的藍色燃料可指示樣品的遷移過程；③80V恒壓電泳40 min；④最后將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統中成像并分析。

2 結果與分析

分別采用CTAB和SDS這2種方法從大豆幼嫩葉片中提取基因組DNA，DNA電泳結果如圖1、圖2所示。從圖中可以直觀地看到，雖然電泳時2組DNA上樣量相同，但DNA條帶亮度有較大區別：

2.1 SDS法提取DNA效果。SDS法(圖1)提取的20個DNA樣品在電泳時發現其DNA條帶亮度較低，有的甚至看不到，說明DNA的量不充足；另外圖1中部分上樣孔較亮，且條帶下方基本都有明顯拖尾現象，這提示該組DNA降解嚴重，也說明該組上樣樣品中可能存在較多雜質(蛋白質、多糖等)，而且由于提取過程中沒有添加RNA酶，所以顯示有9個泳道RNA還比較多，由于這些原因造成DNA純度相對較差。

2.2 CTAB法提取DNA效果。利用CTAB法(見圖2)提取的19個樣品的DNA，每個泳道均顯示出明顯的條帶，說明利用這種方法均提取出各個樣品的基因組DNA，雖然也有拖尾信號，也有部分DNA降解，但是每條DNA條帶均比圖1中的條帶清晰、明亮，說明利用CTAB法比用SDS法更容易提取出樣品的基因組DNA，而且提取的DNA數量更多、質量更好，更能保證后續各項研究的使用。

圖1 SDS法提取的大豆基因組

圖2 CTAB法提取的大豆基因組

3 結論與討論

3.1 本試驗以大豆幼嫩葉片為材料，研究CTAB法和SDS法提取DNA的效果，目的是比較2種方法的優劣，從而篩選出更為高效的大豆DNA提取方法。在本研究中，我們每組的樣本均為1 g大豆幼嫩葉片，從中提取大豆DNA，使得本次檢測結果可以代表大豆整體DNA特點。同時在本研究中的SDS法中，我們使用氯仿代替苯酚抽提去雜質，盡量避免了苯酚導致的DNA降解[15]。雖然我們已優化SDS法，但從研究結果看，SDS法提取DNA仍比CTAB法DNA降解率高。

3.2 CTAB法的核心是CTAB。CTAB陽離子去污劑可使蛋白質變性，同時與變性后的蛋白質和多糖形成復合物，使DNA被完全釋放。之后通過氯仿、不同濃度的鹽溶液去除雜質，最終獲取高質量、降解率低的DNA。本研究圖2的瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示DNA較完整，這與Mafra等人的研究結果相一致。

3.3 SDS法的核心是SDS。SDS使蛋白質變性，之后與蛋白質、多糖形成復合物，釋放DNA。通過此種方法可獲得較多的DNA，但同時存在的問題是最終提取的DNA中雜質較多，DNA純度差，我們的研究亦表明這一點。這些結果與張偉[16]等人的研究結果相一致。

3.4 實際工作中經常涉及到對轉基因大豆基因組的檢測，這就需要我們通過多方比較，篩選出最高效、快捷、經濟的檢測方法。本研究中，CTAB法每次檢測需要5 h左右，而SDS法至少需要7 h，且CTAB法提取DNA純度比SDS法高，由此可見CTAB法步驟簡便、用時短，比起SDS法更適合在實際檢測工作中推廣。

綜上所述，CTAB法提取的DNA純度和完整性較好，DNA降解率極低，且操作步驟簡易、高效，適宜在大豆DNA提取工作中推廣使用。