共生菌對小鼠肺臟組織核轉錄因子κB與抑制性κB激酶α/β及磷脂酰肌醇3-激酶表達的調控作用

查艷芳，楊雯雯，戶守鑫，崔克樂，胡世蓮，程民,

1.中國科學技術大學附屬第一醫院西區(安徽省腫瘤醫院)腫瘤分子實驗室，合肥 230031；2.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)

呼吸道共生菌在維持肺臟免疫穩態以及肺臟疾病發生發展過程中均具有重要作用。腸道共生菌與肺臟關系密切，在體內形成“腸-肺”軸，遠端調控肺臟免疫穩態及免疫應答。核轉錄因子κB(NF-κB)、抑制性κB激酶α/β(IKK-α/β)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等信號通路分子參與多種細胞功能的調節，與炎癥、腫瘤、哮喘等多種肺臟疾病的發生發展密切相關。共生菌對肺臟組織中NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表達水平的調控值得深入研究。本研究通過檢測共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中NF-κB、IKK-α/β、PI3K的表達量及其磷酸化水平，探討共生菌對肺臟NF-κB、IKK-α/β、PI3K表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠(SPF級)購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，5～6周齡，雌性，共12只，按體重隨機分為兩組(實驗組和對照組)，6只/組；飼養條件為22 ℃、55%相對濕度、晝/夜(12 h/12 h)節奏，飼養和實驗操作均遵循中國科學技術大學實驗動物管理規范條例執行。

1.1.2 抗菌藥物 萬古霉素(貨號：S17059)購自上海源葉生物科技有限公司。氨芐青霉素(貨號：A610028)、新霉素(貨號：A610366)和甲硝唑(貨號：A600633)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 組織蛋白提取及定量試劑 Western及IP細胞裂解液(貨號：P0013)及BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0010)購自碧云天生物技術有限公司；磷酸酶抑制劑片(貨號：4906845001)及蛋白酶抑制劑混合片(貨號：04693124001)購自Roche公司。

1.1.4 抗體 NF-κB p65 (L8F6) mouse mAb(貨號：6956)、IKK-α antibody(貨號：2682)、IKK-β (2C8) rabbit mAb(貨號：2370)、PI3 Kinase p85 Antibody(貨號：4292)、phospho-NF-κB (Ser536) (93H1) rabbit mAb(貨號：4025)、phospho-IKK-α/β (Ser176/180) (16A6) rabbit mAb(貨號：2697)、phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) antibody(貨號：4228)、β-actin antibody(貨號：4967)、anti-rabbit IgG HRP-linked antibody(貨號：7074)、anti-mouse IgG HRP-linked antibody(貨號：7076)均購自Cell Signaling公司。

1.1.5 SDS-PAGE電泳、轉膜及顯色試劑 SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號：P0012A)、彩色預染蛋白質分子量標準(貨號：P0068)及極超敏ECL化學發光試劑盒(貨號：P0018FM)均購自碧云天生物技術有限公司；PVDF膜(貨號：IPVH00010)購自Miilipore公司。

1.2 方法

1.2.1 共生菌缺失小鼠模型的建立 使用含萬古霉素(0.5 g/L)、氨芐青霉素(1.0 g/L)、甲硝唑(1.0 g/L)及新霉素(1.0 g/L)4種抗菌藥物的飲用水連續飼喂實驗組C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級，共6只)5周，構建共生菌缺失小鼠模型[1]。實驗過程中對照組小鼠使用不含抗菌藥物的飲用水進行飼喂。

1.2.2 肺臟標本獲取 將共生菌缺失小鼠及正常對照小鼠(各6只)摘眼球取血后，脫臼處死，解剖小鼠。取100 mg肺臟組織，放入1.8 mL凍存管中，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 肺臟組織蛋白提取及定量 取-80 ℃保存的小鼠肺臟組織，每管加入500 μL Western及IP細胞裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，60 Hz，研磨2 min，冰上放置10 min。12 000 g，4 ℃，離心10 min。將上清轉移至1.5 mL無菌EP管中，12 000 g，4 ℃，離心10 min。吸取上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，并將定量后的肺臟蛋白分裝至0.5 mL無菌EP管中，-80 ℃保存，備用。

1.2.4 Western blot檢測 將待測的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳(8%濃縮膠，10%分離膠)，上樣量50 μg總蛋白/孔，濃縮膠80 V，電泳30 min；分離膠120 V，電泳1 h。利用半干法將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜；之后進行封閉、一抗標記、二抗標記等，用ECL發光試劑盒進行顯色，化學發光儀成像，用Image J軟件進行條帶分析。

2 結果

2.1 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中NF-κB的表達情況及其磷酸化水平 利用Western blot方法檢測NF-κB蛋白的表達情況及其磷酸化水平，結果顯示，共生菌缺失小鼠肺臟中NF-κB蛋白的相對表達量為1.609±0.084，較正常小鼠肺臟(1.000±0.000)升高(t=7.287，P<0.01)，磷酸化NF-κB蛋白(pho-NF-κB)的相對表達水平為2.039±0.133，亦高于正常小鼠肺臟(1.000±0.000)(t=7.812；P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot方法檢測共生菌缺失小鼠肺臟組織中NF-κB蛋白的電泳條帶(n=6)

2.2 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中IKK-α、IKK-β的表達情況及其磷酸化水平 利用Western blot方法檢測IKK-α、IKK-β蛋白的表達情況及其磷酸化水平，結果顯示，共生菌缺失小鼠肺臟中IKK-α蛋白的相對表達量為1.206±0.095，與正常小鼠肺臟(1.000±0.000)相比無明顯變化(t=2.170；P=0.055)，IKK-β蛋白的相對表達量為3.389±0.184，較正常小鼠肺臟(1.000±0.000)升高(t=13.012，P<0.01)，磷酸化IKK-α/β蛋白(pho-IKK-α/β)的相對表達水平為1.433±0.053，亦高于正常小鼠肺臟(1.000±0.000)(t=8.203，P<0.01)。見圖2。

圖2 Western blot方法檢測共生菌缺失小鼠肺臟組織中IKK-α、IKK-β蛋白的電泳條帶(n=6)

2.3 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟組織中PI3K的表達情況及其磷酸化水平 利用Western blot方法檢測PI3K蛋白的表達情況及其磷酸化水平，結果顯示，共生菌缺失小鼠肺臟中PI3K蛋白的相對表達量為1.414±0.024，較正常小鼠肺臟(1.000±0.000)升高(t=17.206；P<0.01)，磷酸化PI3K蛋白(pho-PI3K p85/p55)的相對表達水平為3.171±0.237亦高于正常小鼠肺臟(1.000±0.000)(t=9.160；P<0.01)。見圖3。

圖3 Western blot方法檢測共生菌缺失小鼠肺臟組織中PI3K蛋白的電泳條帶(n=6)

3 討論

共生菌在維持黏膜免疫系統穩態中發揮著重要的作用，共生菌與免疫系統之間存在錯綜復雜的關系與精妙的平衡[2]。呼吸道共生菌在維持肺臟免疫穩態以及肺臟疾病發生發展過程中均具有重要作用[3-5]。腸道共生菌亦可遠端調控肺臟免疫穩態及免疫應答[6]。本課題組前期的研究發現，共生菌缺失小鼠較正常小鼠更易發生肺部腫瘤，共生菌缺失導致肺臟γδT細胞及肺泡巨噬細胞功能變化，進而導致腫瘤進展[1,7]，但共生菌缺失對小鼠肺臟組織中信號通路分子，特別是NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表達及其磷酸化水平的影響尚不明確。

在哺乳動物中，NF-κB由5個普遍表達的成員(p50、p52、p65/RelA、RelB和c-Rel)組成，形成同源或異二聚體[8]。在非活性狀態下，NF-κB存在于胞漿內，并與IκB家族(IKKs)的抑制蛋白相結合。細菌脂多糖、病毒、氧化劑、細胞因子等與細胞膜上的受體蛋白結合，活化IKK并釋放NF-κB二聚體，自由的NF-κB進入細胞核，調控靶基因的轉錄表達[9]。IKK作為NF-κB信號轉導途徑的重要成員，包括催化亞基IKKα、IKKβ及調節亞基IKKγ 3個亞基。IKK/NF-κB信號通路在哮喘、神經退行性變、炎癥和癌癥等的發病機制中起著至關重要的作用。IKK-α信號可通過活化Erk、p38和mTor等蛋白，或上調EGFR和NF-κB活性及激活c-Myc、Smad2/3和Snail信號進而加速肺臟腫瘤的進展[10]。IKK-β/NF-κB信號通過調控癌細胞的生存、凋亡和遷移等改變多種腫瘤的致癌能力[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一類調節細胞增殖、代謝、蛋白質合成和存活的胞內磷脂酰肌醇激酶[12]，參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節。PI3K信號通路過度活化與惡性腫瘤的發生發展密切相關。目前，多項臨床試驗均證實了PI3K抑制劑在實體瘤中的療效，包括子宮內膜癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等[13]。在肺癌中，PI3K信號上調表達可促進肺癌細胞增殖、存活和組織侵襲等，PI3K信號上調與口腔部位的共生菌在下呼吸道富集密切相關[4]。

本研究通過檢測共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺臟NF-κB、IKK-α/β及PI3K的表達情況及其磷酸化水平，發現共生菌缺失小鼠肺臟中NF-κB蛋白的表達量及其磷酸化水平均較正常小鼠肺臟升高(P<0.01)；IKK-α蛋白的表達水平與正常小鼠肺臟相比無明顯變化(P>0.05)，但IKK-β蛋白的表達水平及IKK-α/β蛋白的磷酸化程度均高于正常小鼠肺臟組織(P<0.01)；PI3K蛋白的表達水平及PI3K蛋白(p85/p55)的磷酸化程度亦高于正常小鼠肺臟組織(P<0.01)。上述結果表明共生菌可以調控肺臟組織中NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表達量及其磷酸化水平，本研究結果為進一步探索共生菌在肺臟免疫穩態維持、肺臟疾病發生發展過程中的作用及作用機制提供了新的依據和參考。