探究紅曲米的最適紅曲接種量

萬(wàn) 樂(lè) 冀鵬翼 程金新

（中國(guó)人民警察大學(xué)，河北 廊坊 065000）

紅曲是一種歷史悠久的中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，被中醫(yī)認(rèn)為是一種珍貴的保健品，也被廣泛應(yīng)用于食物加工烹飪。

近年研究發(fā)現(xiàn)，紅曲發(fā)酵過(guò)程可以獲得各類活性代謝產(chǎn)品。由于紅曲霉的活性代謝產(chǎn)物豐富，并具有特定的功能，其中某些代謝產(chǎn)物對(duì)人類有藥用價(jià)值，但某些代謝產(chǎn)物具有毒性，對(duì)人體有害。其中，桔霉素具有一定的代表性，東亞以及一些歐洲國(guó)家對(duì)此較為關(guān)注，并進(jìn)行了深入研究。

在近年的研究中，紅曲菌的代謝產(chǎn)物和其代謝產(chǎn)物的抗氧化能力被廣泛地運(yùn)用到動(dòng)物（如斷奶仔豬、山羊等）、植物（如燕麥、苦蕎、金釵石斛、紫蘇葉等）、真菌（香菇等）以及人體的各個(gè)方面（如人體經(jīng)絡(luò)電壓等），紅曲制品也越來(lái)越多（如紅曲餅干、紅曲米、紅曲酒等），筆者從紅曲米入手，再經(jīng)過(guò)微生物、發(fā)酵等相關(guān)知識(shí)，想探究出紅曲米的最適紅曲接種量，從而發(fā)揮紅曲米的最大功效。

在今年的研究中，可以了解到，桔霉素的檢測(cè)方法主要有抑菌圈法、高效毛細(xì)管電泳法、氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

材料包括Tween80、葡萄糖、魚(yú)粉蛋白胨、YeastExtrac、KCl、FeSO·7HO、大米、甲醇、碳酸鈉、蘆丁、沒(méi)食子酸、乙醇、福林酚試劑、NaNO、AlCl、NaOH、DPPH、抗壞血酸、Tris、EDTA·2Na、鹽酸溶液、鄰苯三酚、乙腈、甲酸、磷酸、超純水。

儀器設(shè)備包括單人單面凈化工作臺(tái)、LRH-150B生化培養(yǎng)箱、HC-2066高速離心機(jī)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：unic、ATX124電子天平、CDE-220E2果汁機(jī)、Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)（配置四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、熒光檢測(cè)器）；Agilent6410液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜CitriTsetTM免疫親和柱，免疫親和凈化裝置、桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

甲醇、乙腈、甲酸和磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純。

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：用乙腈將一定量的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋10倍，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

先浸米，把米瀝干，再把瀝干之后的大米滅菌，分別把2%、4%、6%、8%、10%紅曲菌接種到相同量的大米上，然后發(fā)酵7天。把發(fā)酵好的大米分別進(jìn)行烘干、研磨、過(guò)篩的操作，把五種接種量的大米粉末樣品各取0.02g放入試管中，然后加入5mL80%乙醇溶液于45℃下水浴提取1h，待測(cè)提取液制作完畢。

吸取100μL適當(dāng)稀釋的樣液于比色管中，然后加入50μL福林酚試劑，混勻，反應(yīng)3min~8min，再吸取150μL20%NaCO溶液加入比色管中，再加700μL水定容至1mL，混勻，室溫下靜置20min后，于UV-2802S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中波長(zhǎng)為765nm處測(cè)得吸光值，然后通過(guò)制作好的沒(méi)食子酸溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各接種量下樣液總多酚的含量。

吸取100μL適當(dāng)稀釋的酒樣于比色管中，加入蒸餾水定容至500μL，再依次加入5%NaNO30μL，搖勻后靜置反應(yīng)5min，之后再加入10%AlCl30μL，搖勻后靜置6min，依次加入200μL 4% 的 NaOH，搖勻后，繼續(xù)添加240μL70%乙醇定容至1mL，靜置反應(yīng)20min，于UV-2802S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中波長(zhǎng)為510nm處測(cè)吸光值，然后通過(guò)制作好的蘆丁溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各接種量下的樣液總黃酮的含量。

吸取50μL適當(dāng)稀釋的樣液加入比色管中，然后加入400μL60μmDPPH溶液，充分搖勻后，于室溫下，放于暗處，靜置反應(yīng)30min后，在UV-2802S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中515nm下測(cè)吸光值，再根據(jù)以下公式計(jì)算出各接種量下的樣液DPPH自由基清除力。

DPPH 自由基清除率（）的計(jì)算公式如下。

式中：是空白樣的吸光度值；是樣品的吸光度值。

根據(jù)樊祥，禇慶華，伊雄海等人測(cè)定紅曲米中桔霉素含量的免疫親和層析凈化-高效液相色譜法，先配置桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再創(chuàng)造色譜條件，然后用研磨好的紅曲米制作樣液，再通過(guò)一定的試驗(yàn)方法（先用研磨好的紅曲米融入一定量的甲醇磷酸溶液，然后再過(guò)濾，再用磷酸進(jìn)行稀釋，制作出待測(cè)樣液，再將試驗(yàn)裝置連接好，加入樣液，調(diào)節(jié)試驗(yàn)裝置開(kāi)始試驗(yàn)，然后用乙腈洗脫，將洗脫液收集到進(jìn)樣小瓶），來(lái)測(cè)定樣液中桔霉素的含量。之后再進(jìn)行討論分析，討論內(nèi)容包括色譜條件的選擇、標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定下限、樣品分析、質(zhì)譜確認(rèn)。最后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將各接種量下的紅曲米的桔霉素含量作為縱軸，紅曲霉菌接種量作為橫軸，制作出直方圖，來(lái)更清晰地看出紅曲米桔霉素含量和紅曲霉菌接種量之間的關(guān)系，由此來(lái)得出更直觀更有說(shuō)服力的結(jié)論。

色譜條件：Kromasil100-10C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲酸（1+99）溶液與乙腈以體積比1∶1混合的溶液，超聲脫氣30min，流量1.0mL/min，進(jìn)樣量50μL。

熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)350nm，發(fā)射波長(zhǎng)500nm。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）條件：COPCELLPAKC 18色譜柱（50mm×2.0mm，3μm）；流動(dòng)相：A為甲酸（0.1+99.9）溶液B為甲酸-乙腈（0.1+99.9）溶液梯度洗脫；流量0.4mL/min。

電噴霧電離模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，母離子m/z251.1，子離子m/z233.1和m/z215.3；毛細(xì)管電壓4.00kV，去溶劑溫度350℃，去溶劑氣流量10L/min，霧化器壓力0.34MPa，碰撞能量：母離子m/z251.1，碎裂成子離子m/z233.1須電離能量11eV，碎裂成m/z215.3需要電離能量19eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 總多酚的測(cè)定

隨著紅曲菌接種量增大，總多酚含量先削減，后增大，再削減，從表1可以看出，紅曲霉菌接種量為2%時(shí)，樣品總多酚含量為14.55μg/mL；紅曲霉菌接種量為4%時(shí)，樣品總多酚含量為7.13μg/mL；紅曲霉菌接種量為6%時(shí)，樣品總多酚含量為32.85μg/mL；紅曲霉菌接種量為8%時(shí)，樣品總多酚含量為138.11μg/mL；紅曲霉菌接種量為10%時(shí)，樣品總多酚含量為137.58μg/mL。從圖1可以看出，總體上呈現(xiàn)紅曲霉菌接種量增添，樣品總多酚含量增添的趨勢(shì)。為了更好地探究紅曲霉菌最佳接種量，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，在該試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注紅曲霉菌接種量為8%和10%時(shí)的樣品總多酚含量。隨著紅曲霉菌接種量的增添，8%接種量下的樣品總多酚含量卻比10%接種量下的高，猜測(cè)是由于紅曲霉菌接種量越多，其操縱大米基質(zhì)的養(yǎng)分不竭，滋生發(fā)展代謝，導(dǎo)致多酚的含量呈上升趨勢(shì)，但由于紅曲霉菌接種量的增添，毒素的含量也增添，導(dǎo)致8%紅曲霉菌接種量下的總多酚含量最高。

表1 各接種量下紅曲米總多酚含量數(shù)據(jù)

圖1 紅曲米接種量與總多酚含量統(tǒng)計(jì)圖

2.2 總黃酮的測(cè)定

隨著紅曲菌接種量增大，總黃酮含量先削減，后增大，再削減，從表2可以看出，紅曲霉菌接種量為2%時(shí)，樣品總黃酮含量為2.73μg/mL；紅曲霉菌接種量為4%時(shí)，樣品總黃酮含量為1.22μg/mL；紅曲霉菌接種量為6%時(shí)，樣品總黃酮含量為5.48μg/mL；紅曲霉菌接種量為8%時(shí)，樣品總黃酮含量為25.06μg/mL；紅曲霉菌接種量為10%時(shí)，樣品總黃酮含量為24.87μg/mL并且從圖2可以看出，總體上呈現(xiàn)出，隨著紅曲霉菌接種量的增添，樣品總黃酮含量增添的趨勢(shì)。為了更好地探究紅曲霉菌最佳接種量，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，在該試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注8%和10%接種量下總黃酮的含量。跟著紅曲霉菌接種量的增添，8%接種量下的樣品總黃酮含量卻比10%接種量下的高，猜測(cè)是由于紅曲霉菌接種量越多，其操縱大米基質(zhì)的養(yǎng)分不竭，滋生發(fā)展代謝，導(dǎo)致多酚的含量呈上升趨勢(shì)，但由于紅曲霉菌接種量的增添，毒素的含量也增添，導(dǎo)致8%紅曲霉菌接種量下的總黃酮含量最高。

表2 各接種量下紅曲米總黃酮含量數(shù)據(jù)

圖2 紅曲米接種量與總黃酮含量統(tǒng)計(jì)圖

2.3 DPPH自由基清除力的測(cè)定

DDPH自由基較為穩(wěn)定，溶于甲醇溶液顯紫黑色，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室波長(zhǎng)掃描顯示，在515nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸光值。從圖3可以看出，隨著紅曲菌的接種量增大，DPPH自由基斷根率先削減，后增添，再削減，如紅曲霉菌接種量為2%時(shí)，DPPH自由基斷根率為31%；紅曲霉菌接種量為4%時(shí)，DPPH自由基斷根率為26%；紅曲霉菌接種量為8%時(shí)，DPPH自由基斷根率為71%；紅曲霉菌接種量為10%時(shí)，DPPH自由基斷根率為65%，但總體上顯現(xiàn)隨紅曲霉菌接種量增添而增添的趨向。為了更好地探究紅曲霉菌最佳接種量，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，在該試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注8%和10%接種量下的DPPH自由基清除率。隨著紅曲霉菌接種量的增加，8%接種量下的樣品DPPH自由基清除率卻比10%接種量下的高，推測(cè)紅曲菌接種量越大，生長(zhǎng)繁殖越旺盛，產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)（如多酚、黃酮等）基本呈上升趨勢(shì)，但可能因?yàn)榧t曲霉菌接種量的增加，毒素的含量也增加，所以8%接種量下的DPPH自由基清除率最高。

圖3 紅曲米接種量與DPPH自由基清除率統(tǒng)計(jì)圖

2.4 桔霉素含量的測(cè)定

從圖4可以看出，隨著紅曲菌接種量增大，桔霉素含量先削減，后增添，再削減，如紅曲霉菌接種量為2%時(shí)，桔霉素含量為0.0081μg/L；紅曲霉菌接種量為4%時(shí)，桔霉素含量為0.073μg/L；紅曲霉菌接種量為8%時(shí)，桔霉素含量為0.0094μg/L；紅曲霉菌接種量為10%時(shí)，桔霉素含量為0.0191μg/L，但總體上顯現(xiàn)隨紅曲霉菌接種量增添而增添的趨向。為了更好地探究紅曲霉菌最佳接種量，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，在該試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注8%和10%接種量下桔霉素的含量。隨著紅曲霉菌接種量的增加，8%接種量下的樣品桔霉素含量相比2%到6%接種量下的樣品桔霉素含量增加的不多，10%接種量下的樣品桔霉素含量卻驟然增加，推測(cè)是由于紅曲霉菌接種量的增加，代謝產(chǎn)物含量增加，刺激了桔霉素含量的增加。

圖4 紅曲米接種量與桔霉素含量統(tǒng)計(jì)圖

3 結(jié)論

固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，接種量的多少?zèng)Q定著菌體生長(zhǎng)的強(qiáng)弱以及利用底物進(jìn)行代謝的快慢。大米接種一定量的紅曲菌后，其總多酚、總黃酮和抗氧化能力得到提高，效果最好的是8%接種量下的大米，總多酚含量達(dá)到了138.11μg/mL，總黃酮的含量達(dá)到了25.06μg/mL，DPPH自由基斷根率到達(dá)了71%；同時(shí)，當(dāng)接種量到達(dá)10%時(shí)桔霉素含量急劇增加，更能說(shuō)明8%接種量更為合適。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，該文對(duì)紅曲霉培養(yǎng)裝置進(jìn)行了初步設(shè)計(jì)，該裝置的功能是為紅曲霉提供最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，控制紅曲霉產(chǎn)生的毒素含量。該課題研究出的紅曲最適接種量成果可為開(kāi)發(fā)兼具風(fēng)味和保健功能的紅曲產(chǎn)品提供理論依據(jù)，并可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，同時(shí)該課題研究也為如何發(fā)揮出紅曲制品的最大功效作出了貢獻(xiàn)，不只探究紅曲米的最適紅曲接種量，還可以探究紅曲納豆的最適紅曲接種量和紅曲餅干的最適紅曲接種量等；可以從紅曲霉菌的接種量多少來(lái)提高紅曲制品的功效，還可以從控制、減少桔霉素等毒素的含量來(lái)提高紅曲制品的安全性。