斑馬魚食源性腸炎模型及其免疫細胞成像分析方法的建立

黎 明 謝家元， 趙旭陽 李曉敏， 王 銳 單俊瑋 程瑩寅 張婉婷 吳 南， * 夏曉勤， *

(1. 大連海洋大學水產與生命學院， 大連 116023; 2. 中國科學院水生生物研究所， 武漢 430072; 3. 中國科學院大學現代農業科學學院， 北京 100049; 4. 武漢輕工大學動物科學與營養工程學院， 武漢 430000)

水產養殖是一個未來全球優質蛋白供應的重要途徑， 魚類的生長和健康直接影響到水產養殖的可持續發展， 然而食源性腸炎是引起魚類疾病和生長抑制的重要限制性因素[1—3]。豆粕等植物蛋白源作為替代魚粉的典型代表， 會引起魚類豆粕誘導型腸炎(Soybean meal induced enteritis， SBMIE)， 目前已在魚蝦中被報道[4，5]。由于目前水產養殖品種較為分散， 研究系統性不夠， 導致目前還比較缺乏豆粕誘導型腸炎， 以及缺乏基于細胞層面研究腸黏膜免疫細胞對豆粕脅迫的應答機制。

斑馬魚(Danio rerio)， 屬于鯉科魚類， 是水產模式動物， 可發生典型SBMIE[6，7]的癥狀， 已日漸引起水產養殖界的重視。國內外相關魚類營養學、免疫學和腸道微生物學家[8，9]用斑馬魚來研究養殖魚類食源性腸炎[8]。在斑馬魚的腸道免疫階段發育過程中， 固有免疫細胞在受精卵出膜1d后就能被檢測到[10，11]， 而3周之后才出現比較成熟的適應性免疫細胞。這就為斑馬魚幼魚用來分階段研究腸道固有免疫和適應性免疫提供了可行性。最新的研究發現， 斑馬魚在SBMIE的早期階段， 中性粒細胞和巨噬細胞參與炎癥反應[12—14]。而在可自愈的草魚SBMIE炎癥平臺期， 自身免疫相關的Th17反應為主[14]，同時， B淋巴細胞也積極參與抗感染; 在自愈期， 調節性T細胞(Treg)反應為主， 同時天然免疫球蛋白IgM、IL10等抗炎因子也對于食源性腸炎的炎癥恢復都起到重要作用[15]。在斑馬魚轉基因品系方面，目前報道熒光標記的固有免疫細胞包括: 中性粒細胞品系Tg(yz:DsRED2)[16]、Tg(BACmpo:GFP)[8]、巨噬細胞有Tg(mpeg1:EGFP)[17]和Tg(coro1a:DsRed)[18];適應性免疫細胞包括: 淋巴細胞系細胞Tg(rag2:DsRed)[19]和T淋巴細胞Tg(lck:eEFP)[20]等， 這些轉基因細胞標記品系， 被廣泛地用來進行疾病建模的免疫效應分析[8，21]。因此， 采用轉基因斑馬魚品系幼魚， 在腸道固有免疫和適應性免疫各自的發育階段， 進行成像分析SBMIE的免疫細胞學效應是可行的。

目前用斑馬魚幼魚成像來進行腸炎研究， 還存在一些問題。一方面， 短期浸泡引起的全身黏膜反應可能會削弱腸道局部的免疫激活效應[22]， 而浸泡引起的巨噬細胞反應主要集中在因吞咽而起作用的前腸[13，23]， 而非食源性刺激的主要免疫反應部位——后腸; 另一方面， 現有的報道多為急性炎癥反應(表現為固有免疫細胞的聚集)， 而對腸黏膜免疫系統中適應性免疫細胞的研究相對缺乏; 此外， SBMIE的病理表型出現腸黏膜中隱窩深度變淺、固有層增寬等[1，6]， 而目前斑馬魚幼魚的僅有研究集中在幼魚的分子水平[14，24]， 缺乏SBMIE對腸道組織病理水平的探索。因此， 本研究通過運用熒光標記斑馬魚品系， 通過成像的方式， 在固有免疫發育階段和適應性免疫發育階段， 分別建立斑馬魚豆粕誘導的食源性腸炎模型， 揭示了中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞(包括未成熟的淋巴細胞和成熟的T淋巴細胞)在腸黏膜中對豆粕飼料的免疫應答機制， 旨在提供一種快速、可視化的水產動物的食源性腸炎模型及相關功能飼料添加劑的在體研發平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

參照NRC(1993)的魚類營養標準和Bravo-Tello等[7]的飼料配方， 實驗以魚粉(秘魯進口魚粉)和豆粕(膨化豆粕， 美國進口大豆)作為飼料蛋白源， 魚油作為飼料脂肪源(表1)， 建立豆粕誘導的食源性腸炎模型。實驗以50%的豆粕蛋白添加量替代魚粉蛋白添加量， 設計了兩組不同的飼料， 每組含39%的粗蛋白及9%的脂肪， 其中微晶纖維素為填充劑， 維生素預混料和礦物鹽預混料按1%的計量添加， FM表示非炎性飼料， 50SBM表示炎性飼料。在2 mm直徑的雙螺桿制粒機(廣州華工光機電科技有限公司)中制成顆粒飼料， 并在55—60℃烘箱中烘干， 后用小型粉碎機進行粉碎， 先過60目分樣篩，將過60目分樣篩后的飼料再過80目分樣篩， 留下80目分樣篩上面的飼料， 放置在4℃冰箱分管保存待用。

表1 斑馬魚SBMIE建模所用飼料配方Tab. 1 Feed formulations for zebrafish SBMIE modeling

1.2 實驗魚和養殖條件

本實驗所用的Tg(lyz:DsRED2)nz50Tg、Tg(mpeg1:EGFP)ihb20Tg、Tg(lck:eGFP)cz2Tg和Tg(rag2:DsRed)zf411Tg四種轉基因斑馬魚， 均購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center， http://zfish.cn/)。斑馬魚的飼養及繁育在中國科學院水生生物研究所水體生物信息課題組的斑馬魚室內循環水系統中進行， 養殖水溫控制在(28±0.5)℃， 照明周期為光照14h， 黑暗10h， 斑馬魚養殖系統的環境為pH 6.8—8.0， 鹽度0.25‰—0.50‰， 溶氧5—8 mg/L， 總氨氮＜0.02 mg/L， 其他條件參考國家斑馬魚中心。

1.3 轉基因純合子篩選

從國家斑馬魚資源中心購回的4種熒光標記斑馬魚品系， 通過自交及與AB野生型斑馬魚側交， 在產卵后孵化至17d后(17 dpf)， 用MS-222工作液麻醉斑馬魚后在體式熒光顯微鏡(MZ10F， 德國Leica)下挑選熒光魚及統計熒光魚比例， 篩選出Tg(lyz:DsRED2)nz50Tg、Tg(mpeg1:EGFP)ihb20Tg、Tg(lck:eGFP)cz2Tg和Tg(rag2:DsRed)zf411Tg四種熒光魚。將Tg(lyz:DsRED2)nz50Tg和Tg(mpeg1:EGFP)ihb20Tg品系雜交， 獲得Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)雙熒光標記品系， 用于固有免疫階段的成像研究。

1.4 SBMIE建模策略及飼養

用含亞甲基藍的0.3× Danieau’s solution(egg water， 受精卵培養液)[25]收集魚卵， 將其放入分裝至12 cm的玻璃培養皿中， 約100粒/皿左右， 放入光照培養箱[(28±1)℃， 光照14h， 黑暗10h]中孵化， 每天早晚換含亞甲基藍的培養液2次， 并挑出死卵， 3d后(3 dpf)換成不含亞甲基藍的培養液。孵化至5d后(5 dpf)， 分裝入直徑150 mm的無菌培養皿中， 每50尾/皿， 實驗分二組：魚粉組(FM)和豆粕組(50SBM)。固有免疫細胞成像用魚的飼養: 從6—9 dpf分別投喂FM或50SBM飼料共4d， 其中每天投喂3次(9:00—9:30、14:00—14:30、19:00—19:30)， 投喂0.5h后換培養液; 適應性免疫細胞成像用魚的飼養:從5—17 dpf投喂Larval AP100(美國Zeigler公司)的標準幼魚飼料， 然后從18—27 dpf分別投喂FM或50SBM共10d， 后進行固定及熒光成像; 具體投喂策略如圖1A所示， 成像區域如圖1B所示。

圖1 斑馬魚幼魚豆粕誘導的腸炎建模策略 (AP100: 標準飼料， FM: 對照飼料， 50SBM: 炎性飼料)Fig. 1 Strategies for modeling enteritis induced by soybean meal in zebrafish (AP100: the basal diet， FM: the control diet， 50SBM: the inflammatory diet)

1.5 斑馬魚的活體固定及免疫細胞成像

用無菌水配置25×100 mL的MS-222儲液(Tricaine Powder 400 mg， dd H2O 97.9 mL， 1 mol/L Tris-HCl， pH = 9.0， 2.1 mL)， 過0.45 μm的濾膜(Milipore)除菌后放入4℃保存， 其工作液用dd H2O稀釋到1×;用PBS溶液， 配置1%(w/v)的低熔點瓊脂糖， 室溫放置。取每個組飼養結束后的20尾左右的魚苗用MS-222工作液麻醉， 后將麻醉好的魚苗放入共聚焦培養小皿中， 用1%低熔點瓊脂糖進行正側面固定， 平行貼附于共聚焦小皿底部。用激光共聚焦顯微鏡(SP8， Leica， 德國)在10×鏡下同時對紅色熒光、綠色熒光和明場3個通道， 進行幼魚腸道組織區域掃描成像。

1.6 蘇木素-伊紅染色(HE)

取相應不同組處理的27 dpf后的斑馬魚魚苗，放入4%的多聚甲醛固定液中固定; 每個組取3條，進行脫水: 75%酒精處理4h， 85%酒精處理2h，90%酒精處理2h， 95%酒精處理1h， 無水乙醇Ⅰ處理30min， 無水乙醇Ⅱ處理30min; 脫水后放入乙醇∶甲苯(1∶1)5—10min， 二甲苯Ⅰ 5—10min， 二甲苯Ⅱ5—10min進行透明; 后續進行透蠟包埋， 用切片機進行斑馬魚后腸區域連續切片， 厚度為4 μm; 將切片依次放入二甲苯Ⅰ處理20min， 二甲苯Ⅱ處理20min， 無水乙醇Ⅰ處理5min， 無水乙醇Ⅱ處理5min， 75%酒精處理5min， 進行脫蠟; 然后按照蘇木素-伊紅染色試劑盒(碧云天)的說明書， 對切片進行蘇木素-伊紅染色。

1.7 RNA提取及熒光定量分析

飼喂FM或50SBM組飼料的斑馬魚， 在9 dpf (固有免疫分析)或27 dpf (適應性免疫分析)， 取大約15尾/管， 用1 mL RNAlater?RNA Stabilization Solution試劑進行固定， 使用TRIzol法提取混合樣品的RNA， 通過HiScript?II Q Select RT Super Mix for qPCR with gDNA wiper(R223-01)反轉錄成cDNA，并以此作為模板; 利用Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (11202ES03/08/06)試劑在Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR儀上完成熒光定量PCR(qPCR)， 熒光定量PCR采用20 μL反應體系: Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL， Primer F(10 μmol/L) 0.4 μL， Primer R (10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA 2.0 μL， H2O 7.2 μL; 熒光定量PCR反應條件采用兩步法: 95℃ 5min， 95℃ 10s、60℃ 30s (40×)讀板， 65—95℃ 繪制溶解曲線。檢測基因的qPCR引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Tab. 2 Primers used in quantitative real-time

1.8 數據處理及統計分析

幼魚成像的顯微鏡照片用Leica Application Suite X(LAS X:3.4.2.18368)軟件進行不同通道下的圖片處理和熒光細胞數目統計， 細胞的統計參考Hedrera等[6]和Langenau等[20]的方法。隨后用Graph Pad Prism 7.0軟件進行數據分析; HE染色后的切片用多光譜成像顯微切割系統(奧林巴斯熒光顯微鏡& PE)對其進行觀察， 并用明場進行10×、40×鏡下拍照采圖， 后期用ImageJ (1.47v)進行處理。本實驗中所有基因的表達水平以rpl13a為內參基因， 每個樣本的平均Ct值與內參基因的平均Ct值進行歸一化處理， 采用2-ΔΔCt法分析不同基因的表達相對于對照組的變化倍數， 用Graph Pad Prism 7.0軟件進行數據可視化。實驗所得數據用Graph Pad Prism 7.0軟件進行單因素方差分析和非配對t檢驗， 所有的數據均用平均值±標準差的方式表示。

2 結果

2.1 采用固有免疫細胞熒光標記指示斑馬魚腸炎模型的建立

在腸道組織發育的固有免疫階段過程中， 采用Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)的轉基因斑馬魚品系建立食源性腸炎模型(圖2)。在9 dpf， 對中性粒細胞而言， 50%豆粕替代魚粉使細胞均出現橢圓形、突觸型的兩種細胞形態(圖2B′和圖2F′)， 細胞位置呈隨機分布于中后腸(圖2B和圖2F); 巨噬細胞的形態在50%豆粕替代魚粉后出現較多類似細胞突觸形態(圖2C′和圖2G′)且隨機分布于中后腸區域(圖2C和圖2G)。在5 dpf和9 dpf 兩個時期， 對FM組和50SBM組熒光標記的細胞在中后腸區域出現的信號(圖2－3I/J的紅色框)進行了數量統計， 與FM組相比， 發現50SBM組中腸道中性粒細胞和巨噬細胞出現更多的聚集， 并且數量出現差異極顯著(分別為P=0.005、P＜0.001)。

圖2 豆粕替代魚粉對先天免疫細胞的影響Fig. 2 Effects of fishmeal substitution by soybean meal on innate immune cells

2.2 豆粕替代魚粉對固有免疫階段中相關基因mRNA表達的影響

在固有免疫階段中， 對腸道急性炎癥相關的基因進行qPCR檢測(圖3)。與FM組相比， 50%豆粕替代魚粉后會使腸道il-1β、il-8和tnf-alpha基因表達上調， 其中il-1β和tnf-alpha基因具有差異顯著(P＜0.05); 同時， 核轉錄因子nf-kb基因的表達水平也顯著上調(P＜0.05; 圖3A)。此外， 對參與固有免疫階段中主要細胞的標記基因進行了qPCR檢測。結果表明， 與FM組相比， 50%豆粕替代魚粉后會使自然殺傷細胞的標記基因gzma(granzyme a，gzma)、中性粒細胞的標記基因mpx(myeloid-specific peroxidase， mpx)、巨噬細胞的標記基因mpeg1(macrophage expressed gene 1， mpeg1)顯著上調(P＜0.05)。

圖3 豆粕替代魚粉對固有免疫階段中相關基因mRNA表達水平的影響Fig. 3 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on mRNA expression levels of related genes in innate immune stage (Relative fold to FM group)

2.3 采用適應性免疫細胞熒光標記指示斑馬魚腸炎模型的建立

在腸道組織發育的適應性免疫階段過程中， 采用Tg (rag2:DsRed)的熒光標記品系建立食源性腸炎模型(圖4)， 通道下紅色指示的是rag2+淋巴細胞系。在17 dpf， 投喂基礎飼料AP100后， 中后腸區域出現了rag2+淋巴細胞， 細胞形態大多呈橢圓形(圖4B′)。在27 dpf， 一方面， FM組和50SBM組中都有相應rag2+的淋巴細胞出現， FM組中的細胞形態大部分呈現圓形(圖4E′)， 而在飼喂豆粕后，rag2+的淋巴細胞中有較多細胞呈現不規則的突觸形(圖4H′);另一方面， 對斑馬魚中后腸區域出現rag2+的淋巴細胞系數量進行定量統計分析發現(圖4M)， 與FM組相比， 豆粕飼料組的腸道區域中出現了更多rag2+紅色熒光標記細胞的聚集， 且差異極顯著(P＜0.001)。

圖4 豆粕替代魚粉對腸道未成熟淋巴細胞的影響Fig. 4 Effects of fishmeal substitution with soybcan meal on immature lymphocytes in intestine

為了進一步研究T淋巴細胞在食源性腸炎過程中的細胞行為， 采用Tg (lck:lck-eGFP)熒光標記的斑馬魚品系在適應性免疫階段進行食源性腸炎模型的構建(圖5)， 通道下綠色標記的是T淋巴細胞(圖5B和5E)。在27 dpf時期， FM組和50SBM組的腸道中都出現綠色熒光標記的lck+淋巴細胞， 且細胞形態都呈不規則的突觸形， 兩組之間的細胞形態沒有明顯的差異(圖5B′和5E′); 之后通過對腸道區域出現綠色熒光標記的lck+淋巴細胞進行定量的統計分析(圖5G)， 研究發現， 豆粕替代魚粉能顯著地引起T淋巴細胞在腸道區域的聚集(P＜0.0001)。

圖5 豆粕替代魚粉對腸道成熟T淋巴細胞的影響Fig. 5 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on mature T lymphocytes in intestine

2.4 食源性腸炎幼魚模型的建立對適應性免疫階段中腸道形態的影響

為了在病理水平觀察SBMIE模型的建立對腸道組織形態的影響， 在27 dpf， 取FM組和50SBM組做腸道組織的石蠟切片并進行了HE染色(圖6)。FM組腸道形態較為完整， 有比較明顯的腸道絨毛高度(HVI)和隱窩深度， 固有層(LP)有一定的厚度，隨著50%豆粕替代魚粉后， 50SBM組后腸黏膜褶皺程度降低， 隱窩深度變淺， 固有層逐漸消失， 腸上皮細胞核的位置出現紊亂， 腸上皮層的杯狀細胞(GC，HE染色后表現為上皮層的空泡)數量減少。對FM、50SBM組后腸組織中的腸絨毛高度進行統計， 結果表明， 與FM組相比， 50SBM組的腸絨毛高度極顯著變短(P= 0.002)。

圖6 豆粕替代魚粉對斑馬魚幼魚腸道形態的影響Fig. 6 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on intestinal morphology of juvenile zebrafish

2.5 斑馬魚腸炎模型的建立對適應性免疫階段中相關基因mRNA表達的影響

探究食源性腸炎模型對腸道腸黏膜屏障的影響， 我們對腸黏膜物理屏障相關基因的mRNA表達水平進行了qPCR檢測， 其中包括腸道上皮緊密連接、凋亡相關基因的表達情況(圖7A和7B)。一方面， 與FM相比， 50SBM組中緊密連接相關的zo-1、claudin b和claudin c均差異顯著性上調表達(P＜0.05)， 而claudin 15a差異極顯著下調表達(P＜0.01)，此外， 緊密連接相關的ocludin-a、claudin 1和claudin12也表達上調， 但都不具有統計學上的顯著性差異(圖7A)。另一方面， 我們還對引起腸道凋亡相關基因進行了檢測， 與FM相比， 50SBM組中caspase 3和caspase8均表達上調， 其中caspase3上調表達具有顯著性差異(P＜0.05)，caspase8無統計學上的顯著差異; 此外， 我們進一步對腸道增殖標記基因檢測， 腸道上皮細胞的標記基因fabp2(fatty acid-binding protein 2， fabp2)表達顯著上調(P＜0.05，圖7E)。

在腸炎過程中， 腸道免疫屏障發揮了重要的調節功能。隨后對腸黏膜免疫屏障相關基因表達進行了qPCR檢測， 其中包括促炎/抑炎細胞因子、核轉錄因子和免疫細胞的標記maker基因的表達情況。與FM組相比， 50%豆粕替代魚粉會使腸道促炎細胞因子il-1β、il-8和tnf-alpha， 抗炎細胞因子tgf-beta、il-10和mmp9， 炎癥相關的核轉錄因子nfkb和免疫調節的核轉錄因子foxp3a及腸炎相關的tlr4均上調表達， 除il-8、tnf-alpha和tlr4無統計學上的差異顯著外， 其余均具有顯著性差異上調(P＜0.05; 圖7C和7D)。此外， 我們進一步對食源性腸炎過程中細胞的標記基因進行了檢測， 結果表明gzma(granzyme a， gzma)、mpx、mpeg1和T淋巴細胞的標記基因lck(T cell-specific tyrosine kinase， lck)均顯著上調表達(P＜ 0.05， 圖7E)。

圖7 豆粕替代魚粉對適應性免疫階段中相關基因mRNA表達的影響Fig. 7 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on mRNA expression levels of related genes in adaptive immune stage

3 討論

本研究針對水產養殖中常見的食源性腸炎， 采用在遺傳學上已熒光標記免疫細胞的斑馬魚品系，建立了斑馬魚SBMIE幼魚模型， 分別對固有免疫和適應性免疫細胞進行了成像和分子機理的分析。結果表明， 斑馬魚幼魚即可發生類似成魚的腸黏膜免疫調控來應對食源性腸炎的細胞學現象， 可對應到斑馬魚腸道免疫的發育的階段性， 即在胚胎孵化3周之前， 腸道開始擁有固有免疫(Innate immunity)，是機體腸道抵抗外源微生物入侵的第一道防線;3周之后開始出現比較成熟的適應性免疫(Adaptive immunity)， 與固有性免疫一起構成較完整的腸黏膜免疫系統[10，11，26]， 這一特點為斑馬魚用來分階段研究腸道固有免疫和適應性免疫提供了便利。同時，斑馬魚又存在不同免疫細胞標記品系[16，17，19，20]， 為探索SBMIE過程中免疫細胞的動態變化存在可能。

作為水產疾病的模型， 目前建立的斑馬魚幼魚SBMIE模型， 很好地模擬了經濟魚SBMIE中腸黏膜屏障受到了破壞。對魚類SBMIE的損傷機理研究表明， 抗營養因子， 主要為大豆蛋白7s和11S， 能夠引起魚類腸道強烈的過敏性炎癥[28—30]， 作為Th17細胞過敏反應的典型細胞因子IL17在草魚SBMIE中是上調表達的， 是引起腸黏膜炎癥的內因[15]。以上的誘因引起腸上皮中LP層腫脹及淋巴細胞浸潤、隱窩變淺和分泌細胞減少， 因而最終表現為腸絨毛的結構發生萎縮。在對食源性腸炎研究最多的大西洋鮭(Salmo salar)中， SBMIE會造成腸固有層增寬、腸上皮層出現淋巴細胞浸潤、后腸黏膜上皮層可以吸收的空泡排列紊亂[27]。與之類似的是， 我們的HE染色結果中與魚粉組相比， 50%的豆粕替代魚粉也會造成腸道絨毛褶皺高度顯著降低，固有層增寬到與黏膜肌層平行， 腸上皮細胞核的位置出現紊亂， 杯狀細胞數量減少， 隱窩深度的相對較淺并逐漸消失等腸黏膜屏障損傷的病理表現。這也和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[31]、龍膽石斑魚(Epinephelus lanceolatus)[32]和建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)[33]等魚類中豆粕替代魚粉所造成的腸組織損傷結果呼應。

腸黏膜上皮細胞組成緊密連接形成黏膜的物理屏障， 緊密連接相關基因中， ZO-1通過連接肌動蛋白actin為緊密連接提供支撐， 并可以提供細胞內的信號傳遞; Ocludin和Claudins處于腸上皮細胞壁上， 直接調節細間距離， 對于通透性很重要[34]。在眾多Claudin中， Claudin 1和Claudin c都是普遍表達在腸上皮細胞膜上的; Claudin b特異表達在隱窩的細胞膜上; 而Claudin 12和Claudin 15表達在腸上皮靠外的細胞膜頂端[35]。目前豆粕組的緊密連接基因表達分析結果表明， 大多數基因， 包括zo-1、claudin 1、claudin b和claudin c表達上調， 表明50%的豆粕替代魚粉會干擾發育期幼魚的中后腸上皮的緊密連接基因的表達， 這與HE染色結果中27 dpf幼魚腸道切片中腸上皮組織損傷相呼應， 可能與豆粕誘導養殖魚類腸道物理屏障損傷有一定的關系。而claudin15a在豆粕組的下調表達暗示腸內的鈉離子回收功能降低[36]。在腸炎過程中， 腸上皮細胞不僅可以通過產生細胞因子(IL-7、IL-8等)來招募免疫細胞[37]， 而且還會通過加快細胞凋亡[38]。在目前的結果中， 50SBM組凋亡相關基因表達水平上調， 前期研究發現豆粕中的大豆球蛋白等抗營養因子可引起Caco-2細胞死亡[39]， 都表明豆粕替代50%的魚粉會加速腸黏膜細胞凋亡， 同時腸上皮成熟基因fabp2也表達上調， 以上結果暗示了豆粕組腸道上皮層是在更加快速地進行更迭。

在植物性蛋白源引發的腸炎過程中， 腸黏膜免疫系統起到關鍵性的作用， 而目前在經濟魚中， 對SBMIE涉及的免疫細胞的應答研究還比較零散， 且大量集中在免疫細胞產生的細胞因子方面。在斑馬魚腸道炎癥期間， 固有免疫細胞和適應性免疫細胞扮演重要角色， 其中包括巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞等[8]， 這些都是SBMIE過程中參與炎癥反應的免疫細胞[14]。因而， 本研究系統對固有免疫細胞和適應性免疫細胞在SBMIE中的應答進行了分析， 并對細胞因子進行了探討。具體來說， 一方面， 在腸黏膜固有免疫細胞中， 參與SBMIE免疫應答的主要為中性粒細胞和巨噬細胞[40]。因而本研究運用中性粒細胞和巨噬細胞的雙標品系Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)來建立固有免疫階段SBMIE模型可更加實時和綜合定量固有免疫細胞的反應性， 研究發現兩類細胞都顯著增加， 但僅巨噬細胞的形態會改變， 暗示斑馬魚可在腸黏膜中招募固有免疫細胞[12，41]并改變細胞形態來應對急性炎癥， 其中巨噬細胞免疫突觸的形成可能暗示免疫狀態改變， 即M0型向M1(TNF-alpha+標記， 促炎， 產生TNF-alpha)或M2(抑炎， TNF-alpha-)型功能轉變[42]。高豆粕飼料投喂引起的中性粒細胞在腸道區域的招募， 這與斑馬魚中化學試劑誘導腸炎[43—45]和高豆粕飼料對斑馬魚腸巨噬細胞的影響相似[14]。同時， qPCR發現中性粒細胞標記基因—mpx和巨噬細胞的標記基因—mpeg1均表達上調， 進一步暗示了中性粒細胞和巨噬細胞參與了豆粕引起的急性炎癥。此外， 從炎性細胞因子角度來看， 飼喂高豆粕飼料使il-1β、il-8、tnf-alpha及核轉錄因子nfkb上調表達， 說明50%的豆粕替代魚粉引起了急性炎癥反應不僅增加固有免疫細胞， 而且還會產生急性炎癥細胞因子。以上結果表明， 在固有免疫發育階段， 采用Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)的雙熒光標品系進行斑馬魚食源性腸炎模型的構建可顯示食源性腸炎的急性炎癥反應過程。

另一方面， 從適應性免疫來說， 適應性免疫細胞在腸炎發生和自愈過程中參與了重要的調控作用[14，15]。核基因重組激活基因2(Recombination activating gene 2，rag2)， 是編碼參與V(D)J重組免疫球蛋白和T細胞受體基因的重組酶的組成部分， 是淋巴細胞發育不可或缺的重要因子， 僅在未成熟的T/B淋巴細胞中共同表達[19]; T細胞特異性酪氨酸激酶(T cell-specific tyrosine kinase， lck)， 在成熟的T淋巴細胞和未成熟的T淋巴中均有表達[20]。通過Tg(rag2:DsRed)和Tg(lck:lck-eGFP)兩種單熒光標記的斑馬魚幼魚， 在適應性免疫階段構建SBMIE模型， 本研究發現高豆粕投喂能引起腸道區域rag2+淋巴細胞和lck+淋巴細胞顯著增加且lck+淋巴細胞數量高于rag2+淋巴細胞， 這一結果表明未成熟的T/B淋巴細胞和成熟的T淋巴細胞可能均參與了腸炎， 暗示SBMIE過程中與成熟的T淋巴細胞在腸道中的聚集有關。此外在飼喂豆粕飼料后，rag2+淋巴細胞出現了較多突觸型的細胞形態， 而豆粕替代魚粉與否對lck+淋巴細胞形態沒有太大的差異，表明腸炎過程中未成熟的淋巴細胞可能通過改變形態來發揮功能; 而成熟的T淋巴細胞對投喂的飼料具有類似的反應， 可能通過增加數量來應對腸炎。這與Coronado等[14]在斑馬魚腸炎中研究的結果相類似。

從炎癥因子的角度， SBMIE引起腸黏膜免疫的改變表現在LP層免疫細胞產生大量的促炎核轉錄因子(如NF-kb)、促炎細胞因子(IL-1β、IL-8和TNF-alpha等)[46]， 同時機體通過促進免疫細胞分化(如CD4+T細胞向Th1、Th2、Th17和Treg類群)[47]和分泌抗炎細胞因子(TGF-β和IL-10等)[39]來緩解腸炎。如在大西洋鮭SBMIE中，il-17a、il-1β、ifnα、ifnγ、tcrγ、cd4α、cd8β和tgf-β等表達均上調[48]。與FM組相比， 本研究發現， 50%的豆粕替代魚粉會使促炎細胞因子基因il-1β、il-8和tnf-alpha， 抗炎細胞因子基因tgf-β、il-10和mmp9， 炎癥相關轉錄因子基因nf-kb和foxp3a， 此外還有腸炎相關受體基因tlr4的mRNA水平均表達上調， 說明50%的豆粕替代魚粉會造成腸道炎癥因子的表達， 引發腸炎; 而機體通過提高抗炎細胞因子基因(tgf-β和il-10等)及免疫調節相關的核轉錄因子基因foxp3a的表達， 來應對豆粕引發的腸炎， 促進炎癥的緩解， 維持腸道免疫屏障穩定。以上表明， 在適應性免疫發育階段， 采用Tg(rag2:DsRed)和Tg(lck:lck-eGFP)兩種單熒光標品系進行斑馬魚食源性腸炎模型的構建， 可指示適應性免疫細胞參與腸炎的免疫效應。

綜上所述， 采用飼料投喂的策略設計和斑馬魚免疫細胞熒光搭配成像的方式， 有效地模擬了水產養殖常見的食源性腸炎， 能夠可視化呈現出各類免疫細胞在急性炎癥和慢性炎癥各階段的細胞行為及動態變化， 并可在分子病理水平對炎癥進行快速評價。本研究為水產動物的食源性腸炎提供了一個周期短、成本低、直觀的分析模型， 將來可在此基礎上進行功能飼料添加劑的研發。

致謝:

感謝國家斑馬魚資源中心的潘魯媛高級工程師指導斑馬魚養殖， 中國水產科學研究院長江水產研究所蔣明副研究員幫助制作斑馬魚SBMIE建模飼料， 華中農業大學水產學院劉靜霞教授指導幼魚成像分析實驗， 中國科學院水生生物研究所分析測實中心王光欣和周芳工程師協助共聚焦顯微鏡成像實驗。