PEAR1、ApoE基因多態(tài)性與AMI患者易感性及臨床特征的相關(guān)性分析

王黎陽(yáng)，袁義燕，詹雯，齊林

（鄭州市第七人民醫(yī)院心電圖科，鄭州 450016）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）具有高發(fā)病率和高死亡率，是目前威脅人類健康的主要疾病之一。盡管隨著介入治療的發(fā)展，心肌再灌注明顯提升，但住院患者病死率仍達(dá)11%左右，而在存活出院的AMI首次發(fā)作患者中1年內(nèi)再次AMI發(fā)生率為10%~30%[1]。目前已證實(shí)AMI具有家族遺傳因素，另外不良膳食結(jié)構(gòu)、情緒緊張、肥胖、吸煙、高血壓、糖尿病等均會(huì)增加AMI患病風(fēng)險(xiǎn)[2]。近年來(lái)，基因多態(tài)性與AMI易感性的關(guān)系逐漸受到臨床關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)在心腦血管疾病患者中，血小板內(nèi)皮聚集受體-1[3]（platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1）、載脂蛋白E[4]（apolipoprotein E，ApoE）的基因型分布存在差異，PEAR1、ApoE基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化和血脂代謝紊亂具有一定關(guān)聯(lián)，進(jìn)而影響心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，但PEAR1、ApoE基因多態(tài)性與AMI患者易感性是否存在關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步證實(shí)。故本研究分析PEAR1、ApoE基因在AMI患者以及健康人群中的分布特征，并探討PEAR1、ApoE基因多態(tài)性與AMI患者易感性及臨床特征的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究為病例對(duì)照研究，選取2019年1月—2021年2月心內(nèi)科收治的AMI患者183例（病例組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者有典型胸痛癥狀，休息或含服硝酸甘油無(wú)法緩解，且經(jīng)心電圖、心肌損傷標(biāo)記物確診為AMI。（2）年齡≥18歲。（3）病例資料完整。（4）進(jìn)行PEAR1、ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并除AMI以外的其他類型心臟病。（2）合并腦血管疾病、肝腎功能不全、嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液病、感染性疾病、惡性腫瘤。（3）研究近期3個(gè)月內(nèi)參與其他臨床研究。同期選取無(wú)AMI病史的中老年志愿者92例（對(duì)照組）。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，不違背醫(yī)學(xué)倫理，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（文件備案號(hào)：20181014），研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，自愿參與研究。

1.2 方法 試劑：人類PEAR1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法），購(gòu)自福州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司。人類ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法），購(gòu)自廈門(mén)人瑞生物醫(yī)藥科技有限公司。血液DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。儀器：Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。MassARRAY DNA質(zhì)譜基因分析儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

采集外周靜脈血5 L，置于-20℃冰箱保存。參照血液DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，將冰凍的血液融化后，取1 mL血樣依次加入等體積的PBS磷酸鹽緩沖液，12 000 r/min離心5 min，棄上清；再加入10 μL的20 mg/mL的蛋白酶K，55℃水浴10 h；再加入等體積的Tris飽和酚，離心；將上層水相轉(zhuǎn)入另一2 mL離心管中加入等體積的Tris飽和酚，離心；再加入等體積的氯仿異戊醇，離心；再加入2倍體積的冰乙醇，可見(jiàn)絮狀DNA析出；冰浴20 min，再次12 000 r/min離心10 min，沉淀DNA，真空干燥，備用待檢。PEAR1基因多態(tài)性檢測(cè)的原理為利用特異性引物對(duì)突變靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)阻滯野生型基因序列的擴(kuò)增，使用TaqMan探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)PEAR1基因上的rs2768759位點(diǎn)。將PEAR1試劑盒上的試劑冰上融化，離心，設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照，每個(gè)1.5 EP管加入19.7 μL反應(yīng)液、0.3 μL Taq DNA聚合酶、5 μL待檢DNA等，參考說(shuō)明書(shū)操作步驟。將PCR反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中反應(yīng)。設(shè)置PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min，95℃20 s，57℃32 s，5個(gè)循環(huán)，95℃20 s，60℃32 s，40個(gè)循環(huán)，4℃冷卻結(jié)束，收集FAM信號(hào)。人類ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)原理：人類ApoE基因有3種等位基因型ε2、ε3和ε4，檢測(cè)rs429358和rs7412兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，參考說(shuō)明書(shū)操作步驟。

1.3 資料收集 通過(guò)查閱醫(yī)院電子病例系統(tǒng)，收集患者基本資料，包括：性別、年齡、是否肥胖、吸煙史、是否高血壓、是否糖尿病、是否高脂血癥、是否高同型半胱氨酸（Hcy）血癥、冠心病家族史。肥胖[6]定義為體重指數(shù)≥28 kg/m2，體重指數(shù)=體重/身高2。高血壓[7]、糖尿病[8]、高脂血癥[9]、高Hcy血癥的定義參考相關(guān)指南。比較病例組與對(duì)照組的基本臨床資料，比較病例組與對(duì)照組的PEAR1基因型和ApoE基因型的頻率分布，分析PEAR1基因型和ApoE基因型分布與基本臨床資料的相關(guān)性，進(jìn)行AMI易感性的多因素分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。所有計(jì)量資料均符合正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的，使用中位數(shù)（四分位間距）。基因型頻率為計(jì)數(shù)資料，以n（%）描述，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組的臨床資料比較 病例組與對(duì)照組的性別、年齡、冠心病家族史比較無(wú)顯著差異（均P＞0.05）。病例組肥胖、吸煙史、高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy血癥的比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組的臨床資料比較[n（%），±s]Tab 1 Comparison of clinical data between the case group and the control group[n（%），±s]

表1 病例組與對(duì)照組的臨床資料比較[n（%），±s]Tab 1 Comparison of clinical data between the case group and the control group[n（%），±s]

注：Hcy：同型半胱氨酸

指標(biāo) 病例組（n=183） 對(duì)照組（n=92） χ2/t P性別男117（63.93） 55（59.78） 0.450 0.502女66（36.07） 37（40.22）年齡（歲） 60.27±8.26 59.02±8.13 1.190 0.235肥胖 41（22.40） 8（8.70） 7.857 0.005吸煙史 37（20.22） 9（9.78） 4.787 0.029高血壓 93（50.82） 13（14.13）34.790＜0.001糖尿病 46（25.14） 7（7.61） 12.089 0.001高脂血癥 51（27.87） 8（8.70） 13.355＜0.001高Hcy血癥 54（29.51） 10（10.87）11.911 0.001冠心病家族史 20（10.93） 7（7.61） 0.762 0.383

2.2 病例組與對(duì)照組的PEAR1基因型頻率分布比較 病例組、對(duì)照組的PEAR1基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P=0.998，P=0.708）。病例組GG基因型頻率低于對(duì)照組，AA基因型頻率高于對(duì)照組（均P＜0.05）。病例組G等位基因頻率低于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 病例組與對(duì)照組的PEAR1基因型頻率分布比較[n（%）]Tab 2 Comparison of PEAR1 genotype frequency distribution between the case group and the control group[n（%）]

2.3 病例組與對(duì)照組的ApoE基因型頻率分布比較 病例組ε3/ε3基因型頻率低于對(duì)照組，ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型頻率均高于對(duì)照組（均P＜0.05）。病例組ε3等位基因頻率低于對(duì)照組，ε2、ε4等位基因頻率高于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 病例組與對(duì)照組的ApoE基因型頻率分布比較[n（%）]Tab 3 Comparison of ApoE genotype frequency distribution between the case group and the control group[n（%）]

2.4 PEAR1基因型與AMI臨床特征的關(guān)聯(lián) 在AMI患者中，GG基因型、GA基因型、AA基因型患者的性別、年齡、肥胖、吸煙史、高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy血癥、冠心病家族史比較均無(wú)顯著差異（均P＞0.05），PEAR1基因型與AMI臨床特征無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，見(jiàn)表4。

表4 PEAR1基因型與AMI臨床特征的關(guān)聯(lián)[n（%）]Tab 4 Association of PEAR1 genotypes with clinical characteristics of AMI[n（%）]

2.5 ApoE基因型與AMI臨床特征的關(guān)聯(lián) 在AMI患 者 中，ε3/ε3、ε2/ε4、ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型患者的性別、年齡、肥胖、吸煙史、高血壓、糖尿病、高Hcy血癥、冠心病家族史比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。ApoE基因型與高脂血癥有關(guān)聯(lián)，ε3/ε3基因型患者中高脂血癥的比例低于ε2/ε4、ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 ApoE基因型與AMI臨床特征的關(guān)聯(lián)[n（%），±s]Tab 5 Association of ApoE genotypes with clinical characteristics of AMI[n（%），±s]

表5 ApoE基因型與AMI臨床特征的關(guān)聯(lián)[n（%），±s]Tab 5 Association of ApoE genotypes with clinical characteristics of AMI[n（%），±s]

注：ApoE：載脂蛋白E；AMI：急性心肌梗死

指標(biāo) ε3/ε3基因型（n=77）ε2/ε4基因型（n=9）ε2/ε2基因型（n=18）ε2/ε3基因型（n=28）ε3/ε4基因型（n=35）ε4/ε4基因型（n=16） χ2/t P性別男47（61.04） 6（66.67） 10（55.56） 16（57.14） 30（85.71） 8（50.00） 9.965 0.076女30（38.96） 3（33.33） 8（44.44） 12（42.86） 5（14.29） 8（50.00）年齡（歲） 58.45±8.22 58.37±8.05 60.16±8.10 62.03±7.85 61.86±7.49 63.66±7.96 2.028 0.077肥胖 15（19.48） 1（11.11） 6（33.33） 7（25.00） 8（22.86） 4（25.00） 2.450 0.784吸煙史 10（12.99） 3（33.33） 6（33.33） 6（21.43） 10（28.57） 2（12.50） 7.505 0.186高血壓 31（40.26） 7（77.78） 9（50.00） 16（57.14） 20（57.14） 10（62.50） 7.939 0.160糖尿病 13（16.88） 3（33.33） 6（38.89） 8（28.57） 10（28.57） 5（31.25） 5.630 0.344高脂血癥 8（10.39） 2（22.22） 6（33.33） 14（50.00） 16（45.71） 5（31.25） 24.571 ＜0.001高Hcy血癥 19（24.68） 2（22.22） 7（38.89） 9（32.14） 11（31.43） 6（37.50） 2.503 0.776冠心病家族史 5（6.49） 1（11.11） 2（11.11） 4（14.29） 5（14.29） 3（18.75） 3.292 0.655

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路來(lái)影響血小板活化和聚集作用[10]。國(guó)內(nèi)外對(duì)PEAR1基因多態(tài)性的研究尚處于起步階段，PEAR1基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)包括rs2768759位點(diǎn)、rs12041331位點(diǎn)、rs9550270位點(diǎn)等[11-12]，其中與心腦血管疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)以rs2768759位點(diǎn)的研究較為成熟，GG基因型為野生型，GA基因型為雜合突變型，AA基因型為純合突變型。本研究分析PEAR1基因多態(tài)性與AMI易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組GG基因型頻率低于對(duì)照組，AA基因型頻率高于對(duì)照組，病例組G等位基因頻率低于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組。上述說(shuō)明PEAR1基因A等位基因突變?cè)黾覣MI易感性，這與Yao等[13]研究觀點(diǎn)基本一致。PEAR1基因多態(tài)性影響AMI發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不明確，可能與PEAR1突變基因型下調(diào)血小板PEAR1表達(dá)從而改變血小板聚集功能并引起血管內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。研究顯示，PEAR1基因多態(tài)性與心血管事件死亡率存在相關(guān)性，其中AA突變基因型人群的心血管事件死亡風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于GG野生型人群[14]。

ApoE蛋白在脂類代謝中具有重要作用，直接參與脂蛋白的合成、分泌、加工、運(yùn)輸。本研究分析ApoE基因多態(tài)性與AMI易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組ε3/ε3基因型頻率低于對(duì)照組，ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型頻率均高于對(duì)照組，而且病例組ε3等位基因頻率低于對(duì)照組，ε2、ε4等位基因頻率高于對(duì)照組。上述說(shuō)明ApoE基因ε2、ε4等位基因突變?cè)黾覣MI易感性，這與李新等[15]研究觀點(diǎn)基本一致。有研究發(fā)現(xiàn)，與ε3/ε3野生型基因相比，ε2/ε4突變型基因人群AMI患病風(fēng)險(xiǎn)增加37%，ε3/ε4突變型基因人群AMI患病風(fēng)險(xiǎn)增加90%，ε4/ε4突變型基因人群AMI患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.18倍。ApoE基因多態(tài)性影響AMI發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確，可能與ApoE基因突變引起的高脂血癥有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，ε3等位基因具有正常脂代謝調(diào)控作用，當(dāng)ApoE基因突變時(shí)，無(wú)法正常參與脂代謝，血漿中血脂積累增多，沉積在血管壁形成粥樣斑塊，引起動(dòng)脈粥樣硬化[16]。ε2等位基因是Ⅲ型高脂蛋白血癥的高危基因，ε4等位基因升高血漿膽固醇水平，增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)。本研究也發(fā)現(xiàn)，ApoE基因多態(tài)性與性別、年齡、肥胖、吸煙史、高血壓、糖尿病、高Hcy血癥、冠心病家族史無(wú)關(guān)聯(lián)，但與高脂血癥有關(guān)聯(lián)，ε3/ε3基因型患者中高脂血癥的比例低于攜帶ε2、ε4的突變基因型患者。目前研究已經(jīng)證實(shí)ε2、ε4等位基因在高脂血癥以及動(dòng)脈粥樣硬化中的病理作用[17]。ApoE基因多態(tài)性通過(guò)影響脂代謝進(jìn)而影響AMI的發(fā)生和預(yù)后，具體的調(diào)控通路仍待研究探討。

綜上所述，PEAR1、ApoE基因多態(tài)性與AMI易感性有一定關(guān)聯(lián)，PEAR1基因A等位基因突變?cè)黾覣MI易感性，ApoE基因ε2、ε4等位基因突變與高脂血癥有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)PEAR1、ApoE基因，有助于及時(shí)了解患者的基因缺陷和患病風(fēng)險(xiǎn)，為疾病的早知道、早預(yù)防、早治療提供了可能，從而進(jìn)行健康的生活干預(yù)，降低疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于確診患者，通過(guò)檢測(cè)PEAR1、ApoE基因可以從分子基因?qū)W上準(zhǔn)確地找到患病根源，還可以根據(jù)不同的基因多態(tài)性選擇最佳的治療方案，更科學(xué)地指導(dǎo)患者使用藥物的種類和劑量，從而提高治療效果。