HDAC1、MAPK水平與慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者糖皮質激素抵抗的關系

劉春苗，牛春生，楊強

（天津醫科大學寶坻臨床學院，天津市寶坻區人民醫院耳鼻喉科，天津 301800）

慢性鼻-鼻竇炎（CRS）是一種發生于鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥疾病，慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是CRS較為嚴重的一種，可引發嚴重的頭痛、流涕、嗅覺喪失、鼻塞等癥狀，對患者生活質量和身體健康具有較大影響[1]。糖皮質激素（GC）是臨床治療CRSwNP的首選抗炎藥物，對改善患者臨床癥狀療效較好，但部分患者對GC治療不敏感，臨床稱之為GC抵抗，GC抵抗的發生會直接影響GC的治療效果，因此，了解影響GC抵抗發生的危險因素具有重要臨床意義[2-3]。組蛋白去乙酰化酶（HDACs）屬于去乙酰化酶超家族，組蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）是HDACs中研究較多的一種，其水平的高低可反映組蛋白乙酰轉移酶（HAT）和HDAC的動態平衡，HDACs主要分布于細胞核中，參與機體炎癥，可通過調節核因子（NF）-κB信號通路、Toll樣受體4（TLR4）-MyD88信號通路發揮抗炎作用，其中組蛋白修飾是重要組成成分，組蛋白乙酰化/去乙酰化與基因活化密切相關[4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）、c-Jun N末端蛋白激酶（JNK）、p38MAPK 3個亞型，其信號通路主要存在于細胞內，可將細胞外的刺激信號轉導至細胞核，參與細胞炎癥、增殖、轉化、分化及凋亡等多種生物學反應[5]。段甦等[6]通過RT-PCR及免疫組化染色檢查發現HDAC1 mRNA及蛋白表達在鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻息肉中表達上調。同時王彤等[7]對單純CRS及CRSwNP患者MAPK信號通路進行檢測，顯示MAPK通路對鼻黏膜上皮細胞增殖作用在CRS中減弱。近年來有研究指出，HDAC1和MAPK在臨床中存在一定相關性[8]，因此筆者探討HDAC1、MAPK信號傳導通路中ERK、JNK、p38MAPK水平在預測CRSwNP患者GC抵抗中的價值。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月—2020年10月收治的CRSwNP患者60例，根據患者是否存在GC抵抗分為GC抵抗組（n=22）和GC敏感組（n=38），其中GC抵抗組男12例，女10例；年齡25~69歲，平均年齡（38.45±2.31）歲；體重指數（BMI）為19~26 kg/m2，平均BMI（23.56±2.10）kg/m2；GC敏感組男21例，女17例；年齡25~68歲，平均年齡（38.15±2.05）歲；BMI為19~26 kg/m2，平均BMI（23.91±2.34）kg/m2。性別、年齡、BMI兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。已獲院醫學倫理委員會批準（2018-7號）。診斷標準：符合《慢性鼻-鼻竇炎診斷治療指南》[9]中CRSwNP診斷標準。入選標準：（1）符合CRSwNP診斷標準。（2）年齡≥18歲。（3）入組前3個月未接受GC治療。（4）簽署知情同意書。排除標準：（1）變應性鼻炎。（2）免疫缺陷者。（3）合并嚴重肝、肺、腎及心血管疾病。

1.2 方法（1）GC抵抗標準：鼻內鏡下鉗夾活檢法取治療前組織標本。給予甲潑尼龍（天津天藥藥業股份有限公司，國藥準字：H20020224）口服，劑量為24 mg/次，1次/d，持續治療1周后取鼻息肉組織作為GC治療后的樣本。對比治療前后樣本，采用鼻內鏡下息肉Lured-Kennedy改良鼻內鏡評分[8]評估患者對GC治療的反應，Lured-Kennedy共評估6項，每項0~2分，總分為12分，其中Lured-Kennedy評分改善≥1分為GC敏感，否則為GC抵抗。（2）mRNA檢測：常規Trizol（購自美國Invitrogen公司）提取總細胞中RNA，以熒光實時定量反轉錄聚合酶鏈反應（VQ-RT-PCR）逆轉錄cDNA測定HDAC1 mRNA。VQ-RT-PCR反應體系：5×定量PCR緩沖液10 μL，上游引物、下游引物、熒光探針各（10 pmol/μL）1 μL，ddH2O 30 μL，cDNA 5 μL，Taq酶（2 U/μL）1.5 μL，總體積：50 μL。反應條件：3 min 93℃，45 s 93℃，45 s 55℃，共40個循環。反應結束后由計算機對熒光信號進行處理并繪制標準曲線，樣本結果以相對循環閾值法由計算機讀出。VQ-RT-PCR試劑盒由德國Qiagen公司提供，以Primer Premier 5.0軟件設計引物，采用β-actin和GA PDH進行雙內參校正。HDAC1引物和探針由美國ABI公司設計合成，治療前后測定。MAPK相關指標測定：取GC治療前、后的鼻息肉組織，采用VQ-RT-PCR檢測p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA表達量，測定流程同HDAC1 mRNA。VQ-RT-PCR引物序列表見表1。

表1 VQ-RT-PCR引物序列表Tab 1 VQ-RT-PCR primer sequence list

1.3 統計學處理 選用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料采用Kolmogorov-Smirnov法檢驗正態性，正態分布資料按±s表示，兩兩比較行t檢驗；偏態分布資料采用中位數[M（Q1～Q3）]表示，兩兩比較行秩和檢驗；計數資料以（%）表示，組間行χ2檢驗；利用受試者工作特征（ROC）曲線分析HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA對CRSwNP患者GC抵抗發生的預測價值，多因素分析采取非條件Logistic逐步回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA水平比較 治療前兩組各指標水平比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。治療后GC抵抗組HDAC1 mRNA表達量顯著低于GC敏感組，p38MAPK、ERK、JNK mRNA表達量顯著高于GC敏感組（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA比較（±s）Tab 2 Comparison of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA between the two groups（±s）

表2 兩組HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA比較（±s）Tab 2 Comparison of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA between the two groups（±s）

注：GC：糖皮質激素；HDAC1：組蛋白去乙酰化酶1；p38 MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；ERK：細胞外信號調節蛋白激酶；JNK：c-Jun N末端蛋白激酶

GC敏感組（n=38）HDAC1 治療前 0.33±0.02 0.34±0.04治療后 0.55±0.03 0.84±0.07 p38 MAPK治療前 0.74±0.07 0.76±0.06項目 時點 GC抵抗組（n=22）t P 0.279 0.000 0.247治療后 0.56±0.04 0.32±0.05 19.213 0.000 ERK 治療前 0.91±0.07 0.93±0.08 0.975 0.333治療后 0.78±0.06 0.51±0.05 18.721 0.000 JNK 治療前 0.89±0.07 0.87±0.06 1.170 0.247治療后 0.67±0.08 0.34±0.05 19.694 0.000 1.093 18.425 1.170

2.2 HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預測CRSwNP患者GC抵抗發生的ROC曲線分析 經ROC曲線分析，HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預 測CRSwNP患者GC抵抗發生的曲線下面積分別為0.715、0.917、0.863、0.885，均P＜0.05，見表3。HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預測CRSwNP患者GC抵抗發生的ROC曲線見圖1。

表3 HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA預測CRSwNP患者GC抵抗發生的ROC分析Tab 3 ROC analysis of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA predicting the occurrence of GC resistance in patients with CRSwNP

圖1 HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA預測CRSwNP患者GC抵抗發生的ROC曲線Fig 1 ROC curve of HDAC1 mRNA,p38MAPK mRNA,ERK mRNA and JNK mRNA predicting the occurrence of GC resistance in patients with CRSwNP

2.3 CRSwNP患者GC抵抗發生的多因素Logistic回歸分析 將有差異的單因素納入Logistic模型，行量化賦值，因變量為是否發生GC抵抗（是=1，否=0），自變量為HDAC1 mRNA（＜0.660=1，≥0.660=0）、p38MAPK mRNA（≥0.428=1，＜0.428=0）、ERK mRNA（≥0.571=1，＜0.571=0）、JNK mRNA（≥0.510=1，＜0.510=0）。經多因素Logistic回歸分析證實，HDAC1 mRNA＜0.660、p38MAPK mRNA≥0.428、ERK mRNA≥0.571、JNK mRNA≥0.510是CRSwNP患者GC抵抗發生的危險因素，均P＜0.05，見表4。

表4 CRSwNP患者GC抵抗發生的多因素Logistic回歸分析Tab 4 Multivariate Logistic regression analysis of GC resistance in patients with CRSwNP

3 討論

GC的抗炎效果由糖皮質激素受體（GR）介導，GR主要有GRα和GRβ兩種亞型，GRα含量在鼻黏膜中遠大于GRβ，其中GRα活化后可與GC結合產生GR-GC復合物，復合物轉移至細胞核中以同源二聚體形式與靶基因中GC反應元件結合，在其他輔助因子參與下改變靶基因染色體，使其發生重構并激活靶基因轉錄來發揮抗感染、抗炎、抑制免疫等生物學效應[10-11]。而GRβ無法與GC結合，但可競爭性與GRα結合生成異源二聚體來減少GR-GC復合物的產生，同時抑制GRα活性，以此降低GC的抗炎效果，因此，GRα/GRβ比值降低是GC抵抗發生的重要原因[12]。另外，GR可與其他轉錄因子如NF-κB、活化蛋白1（AP-1）相互作用，抑制炎性基因轉錄，從而抑制炎癥因子產生[13]。

本研究中，GC抵抗組HDAC1 mRNA顯著低于GC敏感組，p38MAPK、ERK、JNK mRNA表達量顯著高于GC敏感組，提示上述因素可能是導致CRSwNP患者GC抵抗發生的影響因素。組蛋白乙酰化由HAT和HDAC共同調節，當機體HDAC1表達量下降，HAT和HDAC動態平衡被打破，組蛋白過乙酰化，致使細胞內炎癥相關基因轉錄增多，炎癥蛋白合成增加，阻斷了GC抗炎效果[14-15]；HDAC1表達量下降還可使去乙酰化的NF-κB乙酰化，激發NF-κB活性，導致活化的GC與GRα結合的反應元件能力下降，使GC抗炎作用下降，從而引發GC抵抗[16-17]。

MAPK信號通路可參與上游信號轉導途徑，參與GR亞型的合成，使GRα/GRβ比值發生改變，促使GC抵抗發生[18]。同時MAPK信號通路被不同的細胞外和細胞內刺激激活，如氧化應激、內質網應激等，因此MAPK信號通路可以此調節細胞炎癥、應激、分化、生長等病理和生理過程[19]。MAPK信號通路可被細菌病原體、促炎因子等激活，激活后的MAPK信號通路可從脂質進入細胞核，促使NF-KB活化，并調節相關基因表達來參與機體炎癥反應，促使促炎因子如白介素、腫瘤壞死因子α等產生，誘發GC抵抗[20]。

經多因素Logistic回歸分析及ROC分析證實，HDAC1 mRNA＜0.660、p38MAPK mRNA≥0.428、ERK mRNA≥0.571、JNK mRNA≥0.510是CRSwNP患者GC抵抗發生的危險因素。因此，采用GC對CRSwNP患者進行治療時，臨床需對上述因素予以關注，異常者及時采取相應措施，降低GC抵抗發生。

綜上，CRSwNP患者GC抵抗發生的機制較為復雜，HDAC1及MAPK可直接或間接參與機體許多生理反應過程，在GC抵抗發生中起重要作用。