解淀粉芽孢桿菌ＤＦ－７液體培養基優化及其無菌發酵液穩定性研究

敖靜 李楊 高曉梅 劉曉輝 孫玉祿

摘要：為確定解淀粉芽孢桿菌DF-7的最優液體培養基及其無菌發酵液的穩定性，利用單因素試驗確定了培養基最優碳源為蔗糖，最優氮源為蛋白胨，最優無機鹽為KH2PO4;利用響應面法得到最優培養基為蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L，在最優培養條件下DF-7發酵液OD600值為2.365;DF-7無菌發酵液在40～60℃、pH值為4～8之間、紫外線照射90min及-80℃低溫條件下均有較好的穩定性，說明DF-7無菌發酵液在耐低溫和抗紫外線方面具有較高的研究價值。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;液體培養基優化;響應面法;無菌發酵液;抑菌作用;穩定性

中圖分類號：S182 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0149-06

解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）是一類具有促生作用的植物根際細菌，在促進作物生長、防治病害和改良土壤等方面有著重要作用[1]。有研究表明，解淀粉芽孢桿菌具有廣泛的抗菌能力，對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、橡膠樹褐根病菌（Phellinusnoxius）、橡膠疫霉（Phytophthoraheveae）、小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）、尖孢炭疽病菌（Colletotrichumacutatum）等多種病原真菌具有很好抑制效果，被廣泛應用于農作物病害的防治[2-4]。

目前研究表明，解淀粉芽孢桿菌可通過產生脂肽類抗菌活性物質、植物生長激素和酶類等物質[5，6]抑制植物病原菌，預防植物病害。本研究中解淀粉芽孢桿菌DF-7是從遼寧省朝陽市喀左縣設施溫室土壤中分離所得，具有較高的抗真菌活性，本試驗以尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（F.oxysporumf.sp.cucumerinum）為指示菌，研究DF-7的培養條件和無菌發酵液的穩定性，為開發不同劑型的微生物菌劑和生物農藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

DF-7菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens），由遼寧省微生物科學研究院分離并保存。

病原菌：尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usariumoxysporumf.sp.cucumerinum），由遼寧省微生物科學研究院分離并保存。

LB液體培養基[7];PDA固體培養基[7];立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠型號：LDZX-75KB）;恒溫搖床（上海世平實驗設備有限公司型號：SPF-2008）;可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司型號：T6新悅）;高速冷凍離心機（SIGMA公司型號：3K15）;生化培養箱[中儀國科（北京）科技有限公司型號：SPX-450]。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌發酵液制備 取一環保存于試管中的DF-7菌株接種到100mLLB液體培養基中，37℃、180r/min培養24h得到種子液。將種子液按2%的比例接種至LB液體培養基中，37℃、180r/min培養24h[8]，5000r/min離心10min，0.22μm濾膜過濾，得到無菌發酵液備用。

1.2.2 抑菌作用測定 采用牛津杯法：將1mL尖孢鐮刀菌孢子混懸液（1×106個/mL）與10mL融化冷卻至45℃左右的PDA培養基混合，倒入平皿中冷卻，放置牛津杯，其中加入100μL無菌發酵液，（28±1）℃培養24h，以不含菌的發酵液為空白對照，觀察是否有抑菌圈出現，并測量抑菌圈大小，每個處理3次重復[9]。

1.2.3 液體培養基優化單因素試驗 以LB液體培養基為基礎培養基，用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、檸檬酸鈉、玉米粉、乳糖和麥芽糖替代LB培養基中碳源酵母膏，替代量為20g/L。用硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨、氯化銨、尿素、大豆蛋白胨和硫酸銨替代LB培養基中氮源蛋白胨，替代量為20g/L。用硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、磷酸二氫鉀和氯化鈣替代LB培養基中無機鹽氯化鈉，替代量為5g/L[10]。接種量為2%，裝液量為20%，37℃、180r/min恒溫搖床振蕩培養24h，測OD600值[11]，每個樣品重復3次。

1.2.4 響應面法優化設計 根據培養基單因素試驗結果，以OD600值為響應值，選擇對其影響較顯著的蔗糖（A）、蛋白胨（B）和KH2PO4（C）進行響應面優化試驗，設置試驗為3因素3水平[12]（表1）。

1.2.5 無菌發酵液活性成分穩定性試驗 熱穩定性：將無菌發酵液分別置于40、60、80、100℃水浴中60min和121℃ 20min，冷卻至室溫[13]。

酸堿穩定性：將無菌發酵液用1mol/L的HCl和NaOH調節pH值分別為2、4、6、8、10，置于冰箱4℃保存24h后[14]，將pH值調回至6。

紫外線穩定性：將無菌發酵液敞口置于超凈臺紫外線燈（功率30W）下照射20、40、60、90min[15]。

反復凍融穩定性：將無菌發酵液于-20℃冷凍2h，室溫融化1h，反復凍融3次;將無菌發酵液分別在-20℃和-80℃冰箱中冷凍72h后再融化1h[16]。

以上處理后的樣品均用0.22μm濾膜過濾，以未作處理的無菌發酵液（pH=6.3）為對照。利用1.2.2方法觀察是否產生抑菌圈，并測量抑菌圈大小，每個處理3個重復。

2 結果與分析

2.1 培養基優化單因素試驗

由圖1可以看出，不同碳源、氮源和無機鹽對DF-7的生長量影響較大。當基礎培養基中的碳源被蔗糖取代時DF-7的OD600值最大，為2.077，因此選擇蔗糖為碳源;當蛋白胨被其他物質取代時，DF-7的生長量明顯減少，所以氮源選擇蛋白胨;無機鹽的選擇中，KH2PO4對DF-7的生長有較明顯的促進作用。因此培養基最優碳源、氮源和無機鹽分別為蔗糖、蛋白胨和KH2PO4。

2.2 響應面優化結果

利用DesignExpert8設計試驗，以蔗糖、蛋白胨和KH2PO4為響應變量，OD600為響應值，進行響應面設計（表2）。分析結果見表3，得到回歸方程為Y=2.070+0.230A+0.100B+0.150C+0.071AB+0.170AC-0.071BC -0.190A2 -0.150B2-0.280C2。該模型P=0.0004（P<0.01），表明回歸方程具有統計學意義;其中A、C、AC和A2、C2因素對DF-7的生長量影響極顯著（P<0.01），B和B2因素對DF-7的生長量影響顯著（P<0.05）;AB和BC因素對DF-7的生長量影響不顯著（P>0.05）。

2.3 響應曲面分析及最佳條件驗證

利用DesignExpert8對數據進行分析，構建響應曲面。通過曲面模型（圖2）可知，當蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L時DF-7的OD600值為2.233，驗證試驗OD600值為2.365，說明該模型能夠較好地反映實際情況。

2.4 無菌發酵液活性成分穩定性試驗

由表4可以看出，隨處理溫度升高抑菌圈直徑逐漸減小，40℃時抑菌圈直徑為17.96mm，60℃時抑菌圈直徑（6.35mm）明顯減小，當處理溫度達到80℃時，無菌發酵液未產生抑菌圈，說明溫度高于80℃以后，無菌發酵液失去了抑菌活性。由圖3A可以看出，pH=2時，抑菌圈直徑為7.3mm，當pH在4～8之間，抑菌圈直徑基本無變化，當pH =10時，抑菌圈明顯變?。?6.3mm），說明抑菌作用下降;隨著紫外線照射時長的增加，抑菌作用有所下降，但不明顯，照射90min后抑菌圈直徑仍有16.47mm，說明在90min內DF-7的無菌發酵液具有較好的抗紫外線能力（圖3B）;由反復凍融試驗可知，3種處理方式對無菌濾液抑菌活性影響不大（圖3C），說明無菌濾液在低溫下具有較好的穩定性。

3 討論與結論

本研究利用單因素試驗得到解淀粉芽孢桿菌DF-7的最優碳源為蔗糖，最優氮源為蛋白胨，最優無機鹽為KH2PO4，通過響應面法得到最優培養基為蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L，最優培養條件下DF-7發酵液OD600值為2.365。

本研究從4個方面考察了DF-7無菌發酵液的穩定性。在溫度小于80℃時，隨溫度增加，無菌發酵液抑菌作用下降，說明發酵液中活性成分對高溫較敏感，當溫度高于80℃，未出現抑菌圈，這可能是由于高溫導致發酵液中的活性物質變性[17]，失去了抑菌作用。秦楠等[18]發現一株產抗菌蛋白的解淀粉芽孢桿菌，在40～80℃范圍內抗菌蛋白具有較好的穩定性。發酵液對酸堿度有一定的要求，pH值在4～8范圍內穩定性較好，極酸或極堿的環境下發酵液中活性成分可能變性失活[19]，導致抑菌作用明顯下降。張娟等[20]研究了解淀粉芽孢桿菌活性成分中大環內酯類抗生素的化學性質，結果表明在酸或堿條件下均不穩定，容易失活。無菌發酵液對紫外線具有一定的穩定性，90min內發酵液的抑菌作用基本不變。Wang等[21]由枯草芽孢桿菌中分離到抗菌蛋白，也具有一定的抗紫外線能力。-80℃下對無菌發酵液活性影響不大，說明發酵液在低溫條件下也具有較好的穩定性。以上結果說明DF-7無菌發酵液在耐低溫和抗紫外線方面具有研究價值，下一步將對DF-7無菌發酵液中活性成分以及活性物質的分離進行研究。