青枯病與黑脛病混發煙株發病莖稈組織微生物群落結構與多樣性

汪漢成 向立剛 鄭蘋 蔡劉體 余知和

摘 要： ?為了解青枯病與黑脛病混發煙株莖稈組織的微生物菌群組成，該文采用Illumina Miseq高通量測序技術研究了青枯病與黑脛病混發煙株發病莖稈和健康煙株未發病莖稈組織的真菌、細菌群落結構與多樣性。結果表明：（1）發病莖稈組織中真菌群落豐富度與多樣性較健康莖稈組織低，細菌群落豐富度與多樣性較健康莖稈組織高。（2）健康莖稈組織中的優勢真菌屬為隱球菌屬（Cryptococcus）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium），三者相對豐度之和>80%。（3）發病莖稈組織中的優勢真菌屬為隱球菌屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬和unclassified_f_Davidiellaceae。（4）norank_c_Cyanobacteria和勞爾氏菌屬（Ralstonia）為發病莖稈組織的優勢細菌屬。綜上所述，青枯病與黑脛病混發能夠顯著改變煙株莖稈真菌、細菌群落結構與多樣性，破壞其微生物群落的穩定。

關鍵詞： 青枯病， 黑脛病， 微生物多樣性， Illumina Miseq高通量測序

中圖分類號：? Q945.8

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0228-12

Microbial community structure and diversity of tobacco

stem tissue in the mixture occurences of

bacterial wilt and black shank

WANG Hancheng1*， XIANG Ligang1，2， ZHENG Ping1， CAI Liuti1， YU Zhihe2

（ 1. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China; 2. College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China ）

Abstract：? In order to understand the composition of microbial flora in the stem tissue of tobacco plants mixed occurrence of bacterial wilt and black shank disease. Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to study the structures and diversities of fungal and bacterial communities in diseased and healthy tobacco stems. The results were as follows： （1） The richness and diversity of the fungal community in the diseased stem tissue were lower than those in the healthy stem tissue， and the richness and diversity of the bacterial community in the diseased stem tissue were higher than those in the healthy stem tissue. （2） Cryptococcus， Alternaria and Fusarium were the dominant fungi in the healthy stem tissue， and the sum of the relative abundances of the three genera were more than 80% of the fungal community. （3） Cryptococcus， Alternaria， Fusarium and unclassified_f_Davidiellaceae were the dominant fungi in the diseased stem tissues. （4） norank_c_Cyanobacteria and Ralstonia were the dominant bacteria in diseased stem tissues. The above results indicate that the mixture of bacterial wilt and black shank disease can significantly change the structures and diversities of fungal and bacterial communities， and can also destroy the stability of microbial community in tobacco stem tissue.

Key words： bacterial wilt， black shank， microbial diversity， Illumina Miseq high-throughput sequencing

煙草是我國重要的經濟作物，常年植煙面積達100萬hm2，煙草為我國農民增收和國家稅收增長做出了很大的貢獻（李石力，2017）。煙草根莖性病害是煙草生產上面臨的主要難題，目前已有報道的煙草根莖性病害有煙草青枯病、黑脛病、根黑腐病、立枯病、猝倒病、低頭黑病和空莖病等（柳德普和戴永平，2015）。其中，以煙草青枯病和黑脛病危害最為突出，其發生面積廣，防治難度大，每年因這兩種病害造成的經濟損失高達數千萬元。

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的典型土傳維管束病害（霍沁建等，2007），能夠侵染包括煙草在內的50多個科的450余種植物（Wicker et al.， 2007）。茄科勞爾氏菌共分為5個生理小種，同時又分為5個生化型或生化變種（譚志瓊等，2006;Kumar et al.，2014），我國報道的致病型茄科勞爾氏菌絕大多數為1型生理小種（黃福新等，1998;周澤科等，2013）。煙草黑脛病是由寄生疫霉煙草變種（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起（汪漢成等，2011），能夠對各個生育期的煙株造成危害，且在團棵期和開花現蕾期最為嚴重（王海波等，2018）。與茄科勞爾氏菌一樣，寄生疫霉煙草變種也存在多個生理小種，全世界已發現的寄生疫霉煙草變種共有4個生理小種（戰徊旭等，2015;Gallup et al.，2018），煙草上常見的為0號、1號生理小種（李斌等，2012;張超群等，2016）。因為自然條件下煙草青枯病與煙草黑脛病的發病條件極其相似，所以煙草青枯病與黑脛病常常出現混發的情況（劉烈花，2018;王新等，2018）。

隨著高通量測序技術的快速發展與普及，越來越多的人將其應用于煙草微生態領域的研究，但大都側重于根際土壤微生物（施河麗等，2018;張笑宇等，2019）以及煙株內生菌（林麗等，2017;李盼盼等，2018）的研究，鮮有關于煙株莖稈組織微生態研究的報道。而根際土壤中諸如青枯菌等病原菌和其他微生物均可以通過維管束等轉移至煙株莖、葉等部位，造成煙株地上部分尤其是莖稈微生物群落的變化，甚至失衡，因此，對于發病煙株莖稈微生物群落變化的研究十分必要。為了解煙株感染根莖性病害前后莖稈中微生物群落的變化，本實驗室先后對感染青枯病煙株莖稈真菌、細菌群落結構（向立剛等，2019a），以及感染黑脛病煙株莖稈真菌、細菌群落結構（向立剛等，2019b）進行了研究，掌握了煙株感染青枯病、黑脛病后莖稈中優勢真菌、細菌群落的組成情況。但尚不清楚青枯病與黑脛病混發對煙株發病莖稈組織中真、細菌群落的影響，因此，本文選取青枯病與黑脛病混發煙株莖稈和健康煙株莖稈，運用Illumina高通量測序技術研究同時感染青枯病和黑脛病煙株莖稈組織中真、細菌群落結構與多樣性變化，以期揭示青枯病與黑脛病混發煙株莖稈組織的微生物菌群組成。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年8月于貴州省福泉市煙草科學研究院種植‘云煙87’品種的試驗田（107°30′41″ E，26°44′48″ N），隨機選取3株出現明顯青枯病與黑脛病混發病癥的成熟期煙株，用經高溫滅菌的剪刀剪取發病煙株發病莖稈組織5 cm長的樣品，即為發病莖稈組（BJ），樣品分別編號為AHBJ、BHBJ和CHBJ;在相同田塊，隨機選取肉眼觀察無明顯病癥且長勢良好的3株健壯煙株作為健康莖稈組（J）樣品，取與發病株等高的煙株莖稈組織樣品，樣品編號為AHJ、BHJ和CHJ。采集的組織樣品立即裝入無菌取樣袋中，低溫保藏帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 DNA提取及目標片段PCR擴增

取凍存的莖稈組織樣品，先用剪刀將其剪成小段，隨后放入研缽中加入適量的液氮充分研磨成粉末狀。稱取50 mg組織粉末樣品，采用植物組織DNA提取試劑盒（Qiagen， 69104）提取DNA，具體操作步驟按其操作說明進行。以提取DNA為模板，分別對真菌轉錄間隔區的ITS1區域，細菌16S rRNA基因的V3-V4區進行擴增。ITS區擴增引物為ITS1F （5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R （5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）（White et al.， 1990），細菌16S rRNA基因擴增引物為338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR擴增體系和反應程序參數參照陳乾麗等（2019）的方法進行。最后將滿足建庫要求的產物純化后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Miseq文庫構建和Miseq PE300平臺（Illumina公司）高通量測序。

1.3 生物信息學分析

使用Trimmomatic軟件（Bolger et al.， 2014）優化原始數據，首先根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，然后去除50 bp以下的序列以及含N堿基的序列，去掉引物錯配數大于2的序列，最后過濾掉雙端reads之間的overlap區長度小于10 bp以及錯配率大于0.2的序列。優化后的序列用FLASH軟件（Caporaso et al.， 2011）進行序列拼接。用UPARSE軟件（Edgar， 2013）對97%相似度序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。利用RDP classifier（Wang et al.， 2007）比對Unite數據庫（http：//unite.ut.ee/index.php），對每條ITS序列進行物種分類注釋，比對Silva（http：//www.arb-silva.de）數據庫，對每條16S序列進行物種分類注釋。聚類后的OTU用于物種組成及差異分析、Venn圖繪制、Alpha多樣性分析（Sobs指數、Ace指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數以及Coverage指數）等。本實驗所有生物信息學分析均在上海美吉生物醫藥科技有限公司I-Sanger生信云網站平臺（http：//www.i-sanger.com/project/index.html）操作完成。

2 結果與分析

2.1 數據質控

本次實驗樣品真菌測序共獲得234 080條高質量序列，最大序列長度356 bp，最小序列長度201 bp，平均序列長度257 bp，其中發病莖稈組獲得序列116 717條，健康莖稈組獲得117 363條;細菌測序共獲得217 446條高質量序列，最大序列長度479 bp，最小序列長度254 bp，平均序列長度431 bp，發病莖稈組獲得108 023條，健康莖稈組獲得109 423條。其余單個樣品詳細質控信息見表1。

2.2 OTU聚類分析

如表2所示，發病莖稈組真菌菌落種類較健康莖稈組略有降低，其中門、綱、目、科、屬、種和OTU數分別減少2、3、5、11、14、17、31個;發病莖稈組的細菌菌落較健康莖稈組增加，門、綱、目、科、屬、種和OTU數量分別增加4、6、17、27、61、82、93個。因此，煙草青枯病和黑脛病混發降低了煙株莖稈真菌群落的物種多樣性，增加了莖稈中細菌群落的多樣性。

2.3 群落多樣性、基本結構及組成分析

各樣品的Alpha多樣性指數如表3所示，Ace指數、Chao1指數和Sobs指數用于表示群落豐富度，其數值越大表示群落豐富度越高;Shannon指數和Simpson指數表示群落多樣性，Shannon指數值越大或Simpson指數值越小表示群落多樣性越高。樣品的真菌群落表現為健康莖稈組真菌群落豐富度與多樣性均高于發病莖稈組，但不存在顯著性差異。健康莖稈組細菌群落豐富度與多樣性低于發病莖稈組，不存在顯著性差異。本次所有測序樣品的Coverage指數均大于0.99，表明測序結果能夠較為真實地反映莖稈中實際的菌群組成情況。

圖1為樣品中真菌屬和細菌屬的相對豐度條形圖，相對豐度低于0.1%的菌屬歸入其他（Others）。因為樣本CHBJ與其余兩發病煙株樣本微生物組成存在明顯差異，所以群落分析時不將此樣本數據作為參考。由于數據庫的限制，相對豐度條形圖中還存在部分未鑒定出來的菌屬，其以unclassified_和norank_開頭。健康莖稈樣品中優勢真菌屬為隱球菌屬（Cryptococcus）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium），三者的相對豐度之和大于80%;發病莖稈各樣品的優勢真

Venn圖（圖2）結果顯示發病莖稈組與健康莖稈組樣品共有的真菌屬有50個，其中：隱球菌屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬、unclassified_k_Fungi、unclassified_f_Davidiellaceae為主要菌屬，所占百分比分別為29.01%、28.58%、17.06%、11.95%、10.21%，其余菌屬占比小于1%;發病莖稈組樣品中獨有的屬有10個，分別為unclassified_f_norank_o_Sporidiobolales占比45.83%，Myrmecridium、綠僵菌屬（Metarhizium）、unclassified_f_Psathyrellaceae和枝孢霉屬（Cladosporium）占比均為8.33%，瓶霉菌屬（Phialophora）、unclassified_c_Exobasidiomycetes、unclassified_o_Trechisporales、籃狀菌屬（Talaromyces）和外瓶霉菌屬（Exophiala）占比均為4.17%;健康莖稈組樣品中獨有的屬有24個，物種數占總數百分比大于1%的屬分別為被孢霉屬（Mortierella）42.97%，刺盤孢屬（Colletotrichum）18.75%，unclassified_c_norank_p_Zygomycota 11.72%，unclassified_f_norank 5.47%，帚枝霉屬（Sarocladium）2.34%，unclassified_f_Chaetomiaceae、unclassified_f_norank_o_Trichosphaeriales、unclassified_o_Helotiales、Lophiostoma和Auriculibuller占比均為1.56%。

發病莖稈組與健康莖稈組樣品共有的細菌屬有61個，物種數占比大于1%的屬有norank_c_Cyanobacteria 72.34%，勞爾氏菌屬19.03%和norank_f_Mitochondria 5.84%;發病莖稈組中獨有的細菌屬有79個，物種數占比大于1%的屬有擬桿菌屬（Bacteroides）33.08%，Paenochrobactrum 8.40%，unclassified_f_Alcaligenaceae 6.62%，擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）7.38%，糞產堿菌屬（Alcaligenes）4.07%，塔特姆菌屬（Tatumella）3.56%，Incertae_Sedis_f_Lachnospiraceae 2.80%，鏈霉菌屬（Streptomyces）2.29%，假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）2.04%，薩特氏菌屬（Sutterella）1.78%，假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、食酸菌屬（Acidovorax）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）占比均為1.02%;健康莖稈組中獨有的屬為18個，Allobaculum和Lachnoclostridium物種數占比均為12.50%，Akkermansi和不動桿菌屬（Acinetobacter）占比均為8.33%， 瘤胃球菌屬2

（Ruminococcus_2）、Rheinheimera、Clostridium_sensu_stricto_1、玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）、Sulfuritalea、norank_f_FFCH7168、Niabella、土壤芽胞桿菌屬（Solibacillus）、Pelomonas、Variibacter、Citricoccus、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、Byssovorax和擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）14個菌屬占比均為4.17%。

圖3為莖稈樣品中相對豐度為前30的真菌、細菌菌群熱圖，熱圖上方與左邊分別為樣品層級聚類樹和物種層級聚類樹，兩聚類樹的聚類方式均為Average。真菌菌群中6個樣品共聚為兩大類，AHBJ、BHBJ、CHJ、AHJ和BHJ聚為一類，CHBJ單獨聚為一類，表明CHBJ樣品與其余2個發病煙株莖稈樣品間樣本距離差異較大，健康煙株莖稈樣品間樣本距離較小;細菌菌群中CHBJ與CHJ兩樣品聚為一類，其余4樣品聚為一類，因此，細菌菌群中健康莖稈組與發病莖稈組組內樣本距離均存在較大差異。

2.4 Beta多樣性分析

通過主成分（PCA）分析健康與發病煙株莖稈中真菌、細菌在屬水平組成上的差異。如圖4：a所示，導致發病與健康煙株莖稈真菌群落產生差異的主要因素PC1和PC2分別占全部影響因素的67.36%和26.67%。其中：健康煙株3個莖稈樣品真菌群落組成相似，樣本距離較近;發病煙株3個莖稈樣品真菌群落組成差異較大，樣本距離較遠;發病煙株BHBJ莖稈樣品與健康煙株莖稈樣品樣本距離較近，真菌群落組成差異較小。由圖4：b可知，導致發病與健康煙株莖稈樣品細菌群產生差異的主要因素PC1和PC2分別占全部影響因素的51.66%和17.49%。在PC1的作用下健康煙株莖稈樣品與發病莖稈CHBJ和BHBJ樣品間細菌群落組成差異較小，AHBJ樣品與其余5個樣品間差異較大。整體而言，煙株感染青枯病與黑脛病對莖稈真菌群落結構的影響較大，而對細菌群落結構的影響較小。

LEfSe多級物種差異分析可用于尋找不同分組中具有統計學差異的生物標記菌群。由圖5：A可知，當LDA閾值為4時，健康煙株莖稈樣品中擔子菌門Basidiomycota、Tremellomycetes綱、Tremellales目、norank_o_Tremellales科、Bulleromyces屬和隱球菌屬與發病莖稈樣品存在顯著性差異。如圖5：B所示，發病莖稈與健康莖稈中細菌群落不存在具有統計學差異的生物標記菌群。

3 討論與結論

微生物群落的Alpha多樣性指數用于反映微生物群落結構的復雜程度。一般而言，微生物群落結構越復雜，微生態環境越穩定，群落的多樣性指數也就越高（賀紀正等，2013）。本研究中，發病莖稈樣品較健康莖稈真菌群落種類降低，細菌群落種類增加;發病莖稈組樣品真菌群落豐富度與多樣性低于健康莖稈樣品，細菌群落豐富度與多樣性高于健康莖稈樣品。說明健康煙株莖稈中真菌群落結構優于青枯病和黑脛病混發煙株莖稈，發病煙株莖稈細菌群落結構優于健康煙株莖稈。

健康煙株莖稈中隱球菌屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬為絕對優勢菌屬，而在發病煙株莖稈中不同樣品中真菌組成存在較大差異;除以上3種菌屬外，unclassified_f_Davidiellaceae也為部分發病煙株莖稈中的優勢菌屬。隱球菌屬多為人類疾病病原菌，關于隱球菌導致的植物病害鮮有報道。鏈格孢屬在不同生境中廣泛存在，多數鏈格孢菌能夠引起多種植物病害（黃偉等，2016;劉迪等，2018），

而某些鏈格孢菌由于具備高產纖維素酶的能力而具備開發成生防制劑的潛力。鐮刀菌屬由于種的差異，部分鐮刀菌可產生激素，促進植株的生長發育，有的可降解纖維素和有機物，而另一部分則可侵染多種植株致使植株萎蔫和根部腐爛（張向民，2005）。細菌群落中norank_c_Cyanobacteria為絕對優勢菌，但目前沒有關于藍細菌作為植物內生細菌的報道，其主要分布于淡水、海水和土壤中（李佳霖等，2015）。此次實驗在煙株莖稈中檢測出了藍細菌，可能是煙株葉綠體DNA造成的污染，而norank_f_Mitochondria則可能是煙株細胞線粒體DNA造成的污染。此推斷有待在今后的研究中進一步驗證。所有莖稈中均檢測到了勞爾氏菌屬，但為何健康煙株未表現出明顯的發病跡象，可能與勞爾氏菌屬中存在不同的生理小種有關，不同的生理小種致病力不同，有的生理小種致病力強，而有的卻無致病力（鄒陽等，2013）。有研究報道無致病力的茄科勞爾氏菌可誘導植株產生免疫能力，從而達到抵抗青枯病的效果（陳慶河，2001）。而作為黑脛病病原菌的寄生疫霉煙草變種因為其已劃分為卵菌，不再歸屬于真菌，所以Unite數據庫中沒有相應的序列信息，因此，本次測序結果中未見Phytophthora屬菌群。在本實驗室前期研究結果中感染青枯病煙株莖稈組織中主要細菌屬為勞爾氏菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Gemmatimonas）和腸桿菌屬（Enterobacter），主要真菌包括小畫線殼屬（Monographella）、隱球菌屬、鐮刀菌屬和Coprinopsis;感染黑脛病煙株莖稈組織中主要細菌屬為norank_c_Cyanobacteria，主要真菌屬為隱球菌屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬和紅酵母屬（向立剛等，2019a，b）。相較于青枯病和黑脛病單獨發病的莖稈組織，混合的發病莖稈組織中小畫線殼屬、Coprinopsis和紅酵母屬真菌，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬細菌降為非優勢菌屬。因此，青枯病、黑脛病混發對于煙株莖稈微生物群落的影響有別于兩種病害單獨發生造成影響的疊加。

發病煙株莖稈較健康煙株莖稈中獨有的真菌屬有10個，除去未鑒定到屬的真菌，還有Myrmecridium、綠僵菌屬、枝孢霉屬、瓶霉菌屬、籃狀菌屬和外瓶霉菌屬。綠僵菌屬是廣譜的昆蟲病原真菌（陳名君等，2018），對植物是否存在致病作用目前尚無報道。枝孢霉屬為常見的腐生真菌，部分枝孢霉屬真菌為植物上的病原菌，侵染植株葉片、枝條和果實（呂靖雯等，2018），從病株莖稈中檢測到該菌屬，可能是莖稈感病腐爛后環境中的枝孢霉菌定殖的結果，進而加重煙株莖稈的腐爛程度。瓶霉菌屬等真菌在發病煙株莖稈中可能的作用尚不明確。發病莖稈中獨有的細菌屬為79個，其中，擬桿菌屬和糞產堿菌屬主要為人類臨床上常見病菌，能夠寄居于人體呼吸道和腸道等部位，對煙草無致病報道。擬諾卡氏菌屬是一個經典的絲狀放線菌類群，能夠合成酶抑制劑和抗生素等多種活性物質（李文均等，2016），對植物無致病潛力。鏈霉菌屬多數為腐生好氣性異養菌，大部分鏈霉菌為非致病的污染菌或定殖菌。假丁酸弧菌屬、假黃色單胞菌屬和類芽孢桿菌屬等發病莖稈中獨有的菌屬均沒有使植物致病的報道。

青枯病與黑脛病混發能夠明顯導致煙株莖稈真菌、細菌群落結構與多樣性的改變，破壞了煙株莖稈中微生物群落的穩定。發病后煙株莖稈中真菌群落豐富度與多樣性降低，細菌群落豐富度與多樣性增加，部分腐生真菌、細菌也廣泛定殖于煙株莖稈上。研究結果增加了我們對青枯病與黑脛病混發煙株莖桿組織微生態的認識，但煙草青枯病菌先侵染、黑脛病菌后侵染，煙草黑脛病先侵染、青枯病菌后侵染，以及2種病原菌同時復合侵染引起的煙株病害微生態規律的研究仍有待下一步繼續探索。

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（責任編輯 周翠鳴）

收稿日期：? 2020-12-08

基金項目：? 國家自然科學基金（31960550）;中國煙草總公司科技項目（110202101048[LS-08]）;貴州省科技廳優秀青年人才培養計劃（黔科合平臺人才 [2017]5619）;中國煙草總公司貴州省公司科技項目（201914，2020XM03） [Supported by National Natural Science Foundation of China（31960550）; Science and Technology Project? of China National Tobacco Corporation （110202101048[LS-08]）; Outstanding Young Talent Training Program of Guizhou Provincial Science and Technology Department （QianKehe Platform Talents? [2017] 5619）; Science and Technology Project? of China National Tobacco Corporation Guizhou Provincial Company （201914， 2020XM03）]。

第一作者： 汪漢成（1982-），博士，研究員，主要從事植物保護研究，（E-mail）xiaobaiyang126@hotmail.com。

*通信作者

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