H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白在桿狀病毒中的表達及其免疫效力評估

郭曉琴　張谞霄　馬誠太　歐杰　李柏林　李鑫

摘要： 旨在利用桿狀病毒表達系統構建1株對高致病性H7N9亞型禽流感病毒（A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016）攻擊后的家禽提供保護的候選疫苗株。用同源重組的方法構建1株表達H7N9亞型禽流感病毒（A/chicken/Shaoxing/5201/2013株）血凝素（Hemagglutinin， HA）蛋白的重組桿狀病毒。用PCR技術鑒定重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的遺傳穩定性，用間接免疫熒光方法和Western Blotting方法鑒定HA蛋白的表達情況，用血凝試驗檢測HA蛋白的體外活性，繼而對重組疫苗在無特定病原體（Specific pathogen free， SPF）雞上進行免疫效力試驗，并對免疫后21 d的SPF雞血清進行抗體檢測，對攻毒5 d后的雞咽喉和泄殖腔棉拭子進行病毒分離。結果顯示，重組桿狀病毒rBac-SX5201HA在昆蟲細胞中生長良好，且可穩定高效表達H7 HA蛋白，血凝效價可達26;重組疫苗免疫SPF雞21 d后可誘導28.4血凝抑制（Hemagglutinin inhibition， HI）抗體效價并能抵抗高致病性H7N9亞型禽流感病毒的攻擊，免疫組SPF雞群均未發病或死亡，僅有17%的SPF雞在攻毒后第5 d出現排毒?？梢钥闯?，重組疫苗對高致病性H7N9亞型禽流感病毒攻擊后的SPF雞提供了100%的保護，且可有效抑制病毒在SPF雞體內的復制。

關鍵詞： H7N9亞型禽流感病毒;重組桿狀病毒;血凝素;免疫原性

中圖分類號： S852.65+7 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0143-08

Abstract： The aim of this study is to construct a candidate vaccine strain for protection against highly pathogenic H7N9 subtype avian influenza virus （A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016） in poultry using baculovirus expression system. A recombinant baculovirus （rBac-SX5201HA） expressing H7N9 （A/chicken/Shaoxing/5201/2013） hemagglutinin （HA） protein was constructed. Genetic stability of rBac-SX5201HA was confirmed by PCR. Expression of HA protein was identified by indirect immunofluorescence assay （IFA） and Western blotting. The activity of HA protein in vitro was detected by HA assay. Immunogenicity and efficacy of recombinant vaccine were studied by animal trial on specific pathogen free （SPF） chickens. Antibody titer of chicken serum collected at 21 days after immunization was tested， and virus isolation was performed for chicken oropharyngeal and cloacal cotton swabs at five days post-challenge. The results showed that recombinant baculovirus （rBac-SX5201HA） stably and efficiently expressed H7 HA protein in insect cells， and HA titer could reach 26. The recombinant vaccine induced 28.4 hemagglutinin inhibition （HI） antibody titer in SPF chickens， and could resist the attack of highly pathogenic H7N9 subtype avian influenza virus. The SPF chickens in the immunized group did not get sick or die， and shedding was found from 17% SPF chickens at five days post-challenge. Recombinant vaccine provides protection against highly pathogenic H7N9 subtype avian influenza virus and effectively inhibits virus replication in SPF chickens.

Key words： H7N9 subtype avian influenza virus;recombinant baculovirus;hemagglutinin;immunogenicity

禽流感（Avian influenza， AI）是一種禽類烈性傳染病，會嚴重危害家禽養殖業的發展和人類的健康，從而引起社會的廣泛關注。2013年春季，重組H7N9亞型禽流感在中國暴發，造成不同程度的人群感染和死亡[1]。之后，每年冬春季節均有H7N9流感疫情出現[2]。截至2020年，中國已陸續暴發6波人感染H7N9亞型禽流感的疫情。對2017年出現的H7N9變異毒株進行基因序列分析發現，其血凝素蛋白裂解位點處存在4個連續的堿性氨基酸插入，屬于高致病性流感病毒[3]。2013年2月到2020年5月，聯合國糧食及農業組織已報道出現1 568例人感染H7N9亞型禽流感病毒病例，其中616例死亡。為了人類的健康和家禽養殖業的可持續發展，疫苗免疫是防御H7N9亞型禽流感病毒的有效措施。因此，研制針對H7N9亞型禽流感病毒的疫苗具有重要意義。

傳統的雞胚苗存在雞胚供應不穩定、外源病毒污染風險大、浪費量大等缺點[4]。禽流感DNA疫苗則存在免疫原性弱、表達效率低等缺點[5]。昆蟲桿狀病毒表達系統擺脫了雞胚的限制，具有生產成本低、安全性高、表達的蛋白質生物活性高、免疫原性好及可快速生產等優點[6-9]。昆蟲細胞的培養無需血清，不易受外源病毒和支原體污染，且無需純化。有報道顯示，桿狀病毒自身有一定的免疫佐劑效應，可以增強疫苗的免疫反應[10]。

本研究通過桿狀病毒表達系統構建了1株rBac-SX5201HA疫苗候選株，并對其在昆蟲細胞中的復制能力、血凝素（HA）蛋白的體外活性，HA蛋白的表達水平及其在無特定病原體（Specific pathogen free， SPF）雞上的免疫效力等進行了一系列評估，以期為H7N9重組桿狀病毒疫苗的進一步研究和生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 質粒、細胞

PVL1393質粒、昆蟲Sf9細胞、昆蟲SF+細胞均由勃林格殷格翰公司提供。

1.2 主要試劑

高保真限制性內切酶Bam H I和Eco R I、T4 DNA連接酶、PCR擴增的相關試劑均購自New England Biolabs （NEB）公司;TOP10感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司;質粒抽提試劑盒、DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司;用于Sf9細胞培養的EXcell 420培養基購自Sigma公司;轉染試劑盒、Alexa FluorTM 488羊抗雞抗體購自Invitrogen公司;桿狀病毒DNA購自Expression Systems公司;禽流感H7亞型（H7-Re1）標準抗原和標準血清購自哈爾濱維科生物技術開發公司;山羊抗雞IgY H&L（HRP）購自Abcam公司;4%雞紅細胞購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 質粒PVL1393-SX5201HA的構建

選取GenBank中公布的A/chicken/Shaoxing/5201/2013株的血凝素（HA）基因序列（登錄號：AJJ91725.1）作為供體基因，并根據昆蟲細胞表達系統密碼子偏好性進行堿基優化，由金斯瑞生物科技有限公司合成HA基因。合成的HA基因用Eco R I和Bam H I雙酶切后連接到經相同酶切后的PVL1393載體上，在TOP10感受態細胞上轉化并進行氨芐抗性篩選。然后挑取單克隆培養，抽提質粒后經雙酶切鑒定條帶正確后送到生工生物工程（上海）股份有限公司對HA基因進行測序驗證，陽性重組質粒命名為PVL1393-SX5201HA。

1.4 重組桿狀病毒的遺傳穩定性鑒定

基于同源重組的原理，將PVL1393-SX5201HA質粒和線性化的苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒（AcMNPV）基因組DNA利用Lipofectamine 3000脂質體在Sf9細胞上進行共轉染，4 d后收集上清液，得到rBac-SX5201HA-P1，保存于-80 ℃冰箱中。同時在室溫下對上述轉染后的Sf9細胞用等體積甲醇、丙酮混合溶液進行固定，進行間接免疫熒光（IFA）鑒定。經過3輪空斑純化后，純凈的rBac-SX5201HA-P4在SF+細胞上得到了傳代擴繁，擴繁條件如下：細胞密度為1 ml 1×106個細胞，感染復數（MOI）=0.01， 4 d后收獲上清液并保存在-80 ℃冰箱中。將病毒連續擴繁至P9代，測定每代病毒的半數組織培養物感染劑量（TCID50）。與此同時，提取P1、P8、P9代重組病毒DNA，對重組HA基因片段進行PCR擴增，將其HA序列與原始HA序列進行比對。PVL1393-F引物序列：5′-AAATGATAACCATCTCGC-3′;PVL1393-R引物序列：5′-GTCCAAGTTTCCCTG -3′。

1.5 間接免疫熒光試驗（IFA）

將重組桿狀病毒rBac-SX5201HA-P1、rBac-SX5201HA-P8、rBac-SX5201HA-P9接種Sf9細胞培養5 d后，棄去上清，在室溫下用等體積甲醇、丙酮混合溶液固定細胞20 min后，去掉固定液，于通風櫥內晾干，以H7-Re1亞型陽性血清為一抗（1∶500），以Alexa FluorTM 488羊抗雞抗體為二抗（1∶500），在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western Blotting試驗

將P7～P9代重組桿狀病毒按感染復數為0.1接種SF+細胞，5 d后收獲細胞懸液。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，以H7-Re1亞型陽性血清為一抗（1∶1 000），以山羊抗雞IgY H & L（HRP）作為二抗（1∶2 000），進行Western Blotting試驗。

1.7 重組病毒HA基因編碼蛋白質的表達條件優化

將重組桿狀病毒按MOI=0.1、0.5、1.0分別接種于密度為1 ml 1×106個細胞的懸浮SF+細胞中，在感染后1～6 d對細胞的活率、活細胞數、細胞直徑和細胞懸液的HA效價進行檢測。按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）[11]附錄中的HA試驗方法進行HA效價檢測。

1.8 抗原的準備

準備密度為1 ml 1×106個的SF+細胞，將重組桿狀病毒rBac-SX5201HA-P8按MOI=0.1接種至懸浮SF+細胞中，5 d后收獲細胞懸液。

1.9 疫苗的制備

將礦物油與抗原（方法1.8中的細胞懸液）按2∶1的體積比使用小型乳化機進行乳化，于16 000 r/min乳化3 min，對乳化后的抗原進行無菌和物理性狀檢驗。

1.10 SPF雞免疫效力試驗

本試驗在華南農業大學ABSL-3動物實驗室中進行且經過實驗動物使用與管理委員會批準（編號：AUP-18-53），不同組別的雞配置不同的隔離器。選取高致病性的H7N9亞型禽流感病毒的HZ-3（A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016）毒株作為本試驗的攻毒株。選取29羽健康的10日齡SPF雞并隨機將其分成3組，其中12羽雞經頸部皮下免疫rBac-SX5201HA-P8（免疫劑量為0.5 ml），12羽雞作為攻毒對照組，另外5羽雞作為空白對照組，免疫效力試驗的具體安排見表1。免疫后21 d采集血液樣本，離心后取血清，用商品化H7-Re1作為標準抗原，并按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）附錄方法中的HI試驗方法檢測雞群的HI抗體效價。

免疫后第21 d，對第1組、第2組所有雞經滴鼻進行H7N9病毒A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016（HZ-3）株攻毒，攻毒劑量為5×106.0 EID50/ml。攻毒后，每天觀察、記錄雞的臨床癥狀，持續14 d。攻毒后，若雞出現精神沉郁、羽毛粗亂、呼吸和神經癥狀等任何異常癥狀或特異性死亡，即可判定該雞為高致病性禽流感發病。

攻毒后第5 d[12-13]，采集試驗雞的咽喉、泄殖腔棉拭子，每個樣本接種3枚9～11日齡SPF雞胚，于37 ℃孵育72 h，收集雞胚尿囊液后進行HA效價測定。攻毒后第14 d，將所有存活雞進行安樂死。

2 結果與分析

2.1 重組質粒PVL1393-SX5201HA的雙酶切鑒定

重組質粒PVL1393-SX5201HA經Eco R I、Bam H I雙酶切后，經電泳鑒定，發現在1 700 bp左右有1個特異性條帶（圖1），與目的條帶大小一致。測序后經序列比對分析發現，插入基因的序列與原始合成序列完全一致，無任何基因突變，表明重組質粒PVL1393-SX5201HA構建成功。

2.2 重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的遺傳穩定性鑒定

PCR結果表明，P1、P8、P9代重組桿狀病毒rBac-SX5201HA DNA均可擴增出大小為1 900 bp左右、含目的HA基因的條帶（圖2）。測序后進行序列比對發現，P1、P8、P9代重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的HA基因序列與合成的HA基因序列完全一致。同時對P5～P9代病毒的滴度進行測定發現，隨著重組桿狀病毒rBac-SX5201HA在SF+細胞上的傳代，重組桿狀病毒rBac-SX5201HA的滴度不斷提高，P8代病毒的滴度達到最高值，為1 ml 108.47 TCID50（表2）。因此，選擇P8代病毒用于蛋白質表達優化試驗和抗原制備。

2.3 rBac-SX5201HA的間接免疫熒光鑒定

被重組桿狀病毒rBac-SX5201HA-P1、rBac-SX5201HA-P8、rBac-SX5201HA-P9感染的Sf9細胞可見特異性綠色熒光，對照組均未見熒光，表明本試驗成功拯救了重組桿狀病毒rBac-SX5201HA，并且其在Sf9細胞中可有效表達H7 HA蛋白。rBac-SX5201HA的間接免疫熒光鑒定結果見圖3。

2.4 HA蛋白的表達及鑒定

Western Blotting鑒定結果（圖4）顯示，在重組桿狀病毒rBac-SX5201HA感染的SF+細胞懸液中可以檢測到1條相對分子質量為70 000左右的條帶，表明重組rBac-SX5201HA的HA蛋白在SF+細胞中獲得成功表達。

2.5 HA蛋白表達條件的優化

由圖5可以看出，感染后的活細胞數先增加，當MOI=0.1時，在感染后第3 d活細胞數達到峰值;當MOI=0.5、1.0時，在感染后第2 d活細胞數達到峰值，隨后活細胞數急速下降，在感染后第6 d細胞幾乎全部死亡。從感染后第1 d開始，SF+細胞的平均直徑先不斷變大，當MOI=1.0時，在感染后第2 d細胞平均直徑達到峰值;當MOI=0.1、0.5時，在感染后第3 d細胞平均直徑達到峰值，然后細胞平均直徑不斷變小。感染后的細胞活率不斷下降，并在感染后第5 d降到15%以下。血凝活性檢測結果表明，在感染后第3～6 d，不同MOI感染組的HA效價均可保持在26（25 μl細胞懸液）的水平。為了便于后期大規模生產，最終選取MOI=0.1、感染后第5 d收獲細胞懸液進行動物試驗用抗原的制備。

2.6 疫苗的準備及檢驗

將rBac-SX5201HA-P8按MOI=0.1的感染復數接種至SF+細胞中，感染后5 d收獲細胞懸液，25 μl細胞懸液的HA效價為26（圖6）。對乳化后的rBac-SX5201HA抗原進行質量檢驗，從疫苗檢驗結果可以看出，本研究制備的抗原為均一的乳白色乳劑，無明顯分層或破乳，瓶底無水相析出;劑型為油包水（W/O）;滴水檢驗結果顯示，除第1滴外，其余5滴在10 s內無明顯擴散;3 000 r/min離心結果顯示，管底無水相析出;黏度為44.2 cP;粒徑為0.7 μm;無菌檢測結果顯示無細菌和霉菌生長。由此可見，疫苗質量合格。

2.7 免疫效力評估

HI檢測結果表明，免疫組雞血清HI抗體平均效價可達28.4，而未免疫組雞群中均未檢測到HI抗體，表明疫苗免疫可誘導較高的HI抗體水平（表3）。以高致病性H7N9亞型禽流感病毒HZ-3株作為攻毒株，攻毒后4 d內攻毒對照組雞群全部發病死亡，其他雞群在臨床觀察期間均未有發病死亡的情況（圖7）。攻毒后5 d，病毒分離結果表明，免疫組1羽雞發現咽喉排毒，另1羽雞發現泄殖腔排毒，總體排毒率為17%;免疫組其他雞和健康對照組雞的咽喉、泄殖腔均未檢測到排毒。由此可見，重組桿狀病毒rBac-SX5201HA可對H7N9亞型禽流感病毒HZ-3株攻擊后的SPF雞提供保護，且可有效抑制病毒在雞體內的復制。

3 討論

目前一般多用桿狀病毒表達禽流感的HA、NA、M1和M2等蛋白質和病毒樣粒子。2013年，由Protein Sciences Corporation利用桿狀病毒表達系統（BEVS）研制的第1支禽流感重組三價疫苗FluBolk成功上市[14]，FluBolk四價流感疫苗于2016年獲批上市，該疫苗與雞胚源四價流感疫苗相比，具有免疫效果好、成本低等優點[15]。除此之外，Novavax公司利用桿狀病毒表達的病毒樣顆粒流感疫苗正處在臨床階段[16-17]。HA蛋白是決定禽流感病毒免疫原性的主要蛋白質。孫一等[18]成功構建的重組桿狀病毒rBac-GD15HA、張雪花等[19]成功構建的表達H5亞型禽流感病毒 HA 蛋白共有序列的桿狀病毒、Lin等[20]成功構建的BV-Dual-HA都可對禽流感病毒攻擊后的動物提供很好的保護作用，這為利用桿狀病毒表達系統研制理想的禽流感疫苗提供了重要的試驗依據。

禽流感病毒隨著HA基因突變而不斷變異。為了獲得1株具有廣譜保護效果的禽流感疫苗，筆者對H7 HA基因序列進行了比對，選取了與保守基因序列相似性較高的H7N9亞型禽流感病毒（A/chicken/Shaoxing/5201/2013株）HA基因作為供體基因。本研究對供體HA基因在昆蟲細胞表達系統中的密碼子偏好性進行了堿基優化，成功構建了重組桿狀病毒rBac-SX5201HA，發現其可在培養（無血清）的昆蟲懸浮細胞系SF+中穩定表達具有良好免疫原性的HA蛋白，且對高致病性H7N9亞型禽流感病毒攻擊后的SPF雞提供了100%的保護，可有效預防H7N9亞型禽流感病毒感染家禽。病毒分離結果顯示，攻毒5 d后，免疫組SPF雞僅出現17%的排毒，顯著抑制了禽流感病毒在SPF雞體內的復制。HI效價被廣泛用于評估禽流感疫苗的免疫原性和保護效力。本研究構建的重組桿狀病毒rBac-SX5201HA免疫組雞血清HI抗體平均效價可達28.4，與Hu等[21]構建的重組桿狀病毒rBac-JX148HA相比，免疫劑量低且可以誘導更高的HI抗體水平。本研究為利用桿狀病毒表達系統在懸浮培養（無血清）的昆蟲細胞系中表達無需純化的HA蛋白的禽流感亞單位疫苗研發提供了實踐依據。

在重組桿狀病毒rBac-SX5201HA表達的HA蛋白產量方面，后續本研究團隊將嘗試用其他昆蟲細胞培養基及不同的SF+細胞密度進行蛋白質表達水平的優化。對于該疫苗的交叉保護性、該疫苗株在不同品種雞中的免疫應答反應、不同免疫途徑的保護效果、最小免疫劑量及免疫程序的確定等仍需要進一步探究。

致謝： 誠摯感謝勃林格殷格翰動物保健（中國）有限公司上海分公司對本試驗的資助和華南農業大學對本試驗提供的大力幫助！

參考文獻：

[1] TANG R B， CHEN H L. An overview of the recent outbreaks of the avian-origin influenza A （H7N9） virus in the human[J].Journal of the Chinese Medical Association，2013，76（5）：245-248.

[2] WANG X L， JIANG H， WU P， et al. Epidemiology of avian influenza A H7N9 virus in human beings across five epidemics in mainland China， 2013-17： an epidemiological study of laboratory-confirmed case series[J].The Lancet Infectious Diseases，2017，17（8）：822-832.

[3] CHU K W， LIN Q， LIU J， et al. Human infection with highly pathogenic avian influenza A （H7N9） virus， China[J].Emerging Infectious Diseases，2017，23（8）：1332-1340.

[4] PLOTKIN S， ORENSTEIN W， OFFIT P， et al. Plotkin’s vaccines[M]. Seventh edition. Netherlands： Elsevier， 2017.

[5] 馮亞亞，郭 晶，李玉保，等.禽流感DNA疫苗研究進展[J].中國畜牧獸醫，2020，47（11）：3667-3675.

[6] PARTRIDGE J， KIENY M P. Global production of seasonal and pandemic （H1N1） influenza vaccines in 2009-2010 and comparison with previous estimates and global action plan targets[J]. Vaccine，2010，28（30）： 4709-4712.

[7] 呂 讓，毛雅元，楊國輝，等.禽流感新型疫苗研究進展[J].中國畜牧獸醫，2015，42（6）：1608-1612.

[8] 查國飛.禽流感疫苗的研究進展[J].當代畜禽養殖業，2018（9）：4-5.

[9] 周賽賽，貢 嘎，錢雯嫻，等.禽流感病毒疫苗研究進展[J].甘肅畜牧獸醫，2019，49（10）：17-22.

[10]ABE T， TAKAHASHI H， HAMAZAKI H， et al. Baculovirus induces an innate immune response and confers protection from lethal influenza virus infection in mice[J].Journal of Immunology，2003，171（3）： 1133-1139.

[11]中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國農業出版社，2020：3403-3404.

[12]XIE X T， YITBAREK A， KHAN S U， et al. A within-host mathematical model of H9N2 avian influenza infection and type-I interferon response pathways in chickens[J].Journal of Theoretical Biology， 2020，499：110320.

[13]LIU K T， GAO R Y， WANG X Q， et al. Pathogenicity and transmissibility of clade 2.3.4.4 highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N6 in pigeons[J].Veterinary Microbiology，2020，247：108776.

[14]COX M M J， PATRIARCA P A， TREANOR J. FluBlok， a recombinant hemagglutinin influenza vaccine[J]. Influenza Other Respir Viruses，2008，2（6）：211-219.

[15]DIVINO V， KRISHNARAJAH G， PELTON S I， et al. A real-world study evaluating the relative vaccine effectiveness of a cell-based quadrivalent influenza vaccine compared to egg-based quadrivalent influenza vaccine in the US during the 2017-18 influenza season[J].Vaccine，2020，38（40）：6334-6343.

[16]SMITH G， LIU Y， FLYER D， et al. Novel hemagglutinin nanoparticle influenza vaccine with Matrix-MTM adjuvant induces hemagglutination inhibition， neutralizing， and protective responses in ferrets against homologous and drifted A（H3N2） subtypes[J].Vaccine，2017，35（40）：5366-5372.

[17]LPEZ-MACíAS C， FERAT-OSORIO E， TENORIO-CALVO A， et al. Safety and immunogenicity of a virus-like particle pandemic influenza A （H1N1） 2009 vaccine in a blinded， randomized， placebo-controlled trial of adults in Mexico[J].Vaccine，2011，29（44）：7826-7834.

[18]孫 一，李如夢，李 軍，等.表達高致病性H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組桿狀病毒疫苗候選株的構建與免疫效果評估[J].中國家禽，2019，41（18）：18-23.

[19]張雪花，陸吉虎，華 濤，等.通用型H5亞型禽流感病毒亞單位疫苗抗原表達和免疫效力研究[J].病毒學報，2019，35（6）：864-872.

[20]LIN W Y， FAN H Y， CHENG X L， et al. A baculovirus dual expression system-based vaccine confers complete protection against lethal challenge with H9N2 avian influenza virus in mice[J].Virology Journal， 2011，8：273.

[21]HU J， LIANG Y Y， HU Z L， et al. Recombinant baculovirus vaccine expressing hemagglutinin of H7N9 avian influenza virus confers full protection against lethal highly pathogenic H7N9 virus infection in chickens[J].Archives of Virology，2019，164（3）：807-817.

（責任編輯：徐 艷）

1183501186244