2010-2019年中國豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） ORF5基因的遺傳進化與重組分析

覃新云　劉桂秀　呂其壯　鄧家華　覃婷　龍金桃　陳旭健

關鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒;ORF5基因;遺傳進化分析;重組分析

中圖分類號： S852.65 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0285-04

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome virus;ORF5 gene;genetic evolutionary analysis;recombination analysis

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），俗稱“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性、具有高度傳染性疾病，其主要臨床癥狀表現為持續高熱、母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸困難和高死亡率[1-2]。PRRS最早發現于美國的北卡羅來納州，隨后世界各國陸續報道，中國于1996年首次報道該病。2006年出現了由高致病性PRRSV引起的“豬無名高熱癥”疫情的大面積暴發和流行，導致豬群高發病率及高死亡率，給養豬業造成了巨大的經濟損失[3]。

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組長度約14 500 bp，編碼區至少包括10個開放閱讀框（ORF）[4]。其中，ORF5基因可以編碼病毒的主要結構蛋白GP5，該蛋白質是一種糖基化囊膜蛋白質，也是PRRSV 誘導機體產生中和抗體的主要抗原[5]。研究結果證實，GP5蛋白是PRRSV中最容易發生變異的蛋白質之一，常被用作評價PRRSV病毒是否發生變異的主要依據之一，ORF5基因也因此成為序列分析的典型基因，可作為PRRSV基因分型的重要依據，在PRRSV流行性株遺傳變異研究中發揮重要作用[6]。當前在中國境內的PRRSV可分為2個血清型，即PRRSV2 （以VR-2332毒株為代表）和PRRSV1 （以Lelystadvirus毒株為代表），其中PRRSV2又可分為5個基因亞型（lineage 1、lineage 3、lineage 5、lineage 8、lineage 9），lineage 1包含NADC30、JL580等毒株;lineage 3包含QYYZ、GM2等近年來在華南地區流行的低致病毒株;lineage 5包含PRRSV2代表毒株VR-2332;lineage 8包含以TJ、JXA1、TA-12等高致病毒株和以CH-1a等為代表的經典毒株及2011年于新疆地區發現的lineage 9[7-11]。

為研究中國近年來PRRSV流行毒株和變異特征，本研究從GenBank中隨機取回分離于中國2010-2019年的877株PRRSV的ORF5基因序列，并對其進行遺傳進化和重組分析，以期為監測中國豬群中PRRSV的變異情況和防控PRRS提供參考。

1 材料與方法

1.1 PRRSV ORF5基因序列的收集

從GenBank數據庫中隨機取回877株2010-2019年分離于中國29個省、市和自治區的PRRSV的ORF5全基因序列作為分析樣本，同時，收集24株各PRRSV基因亞型的代表毒株和22株鄰國毒株作為參考毒株。為了更好地呈現分析結果，在877株毒株中隨機選取98株代表毒株用于后續分析。

1.2 PRRSV ORF5基因的系統發育分析

采用Neighbour-joining （NJ）方法，參照文獻[12]進行參數設置，利用軟件MEGA v.10.0.5繪制本研究獲得的877株PRRSV的ORF5基因序列與參考毒株ORF5基因序列的分子進化樹，應用徐錚等[13]提出的基因分型方法對毒株進行類群劃分并分析其進化關系及各基因亞型在中國的流行情況。

1.3 PRRSV ORF5基因序列分析

利用DNAstar中的MegAlign程序將收集的ORF5基因序列與參考毒株的ORF5基因序列進行核苷酸同源性分析，并對ORF5基因推導的氨基酸序列進行對比分析，其中以PRRSV2代表毒株VR-2332為氨基酸序列比對時的標準毒株[6，8]。

1.4 PRRSV ORF5基因的重組分析

為研究所收集毒株之間的基因重組情況，利用軟件RDP4.0中的7種檢測算法[RDP （R）、MaxChi （M）、BootScan （B）、GeneConv （G）、3seq （T）、SiScan （S）和Chimaera （C）]對獲得的ORF5基因進行重組分析，并參照文獻[14-15]中的判定依據對檢測出的重組事件進行界定。

2 結果與分析

2.1 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性比對及遺傳演化分析

分析結果顯示，PRRSV ORF5基因序列的長度為600 bp、603 bp和606 bp，核苷酸同源性為59.6%～100.0%，與國內外46株參考毒株的ORF5基因同源性為59.4%～100.0%。ORF5基因進化樹分析結果表明，877株PRRSV毒株中有15株為PRRSV1，862株為PRRSV2毒株。PRRSV2又可進一步劃分為多個不同基因亞型，其中高致病性毒株（亞型1）有517株、經典毒株（亞型2）有74株、廣東新變異毒株（亞型3）有62株、JXA-R疫苗樣毒株（亞型4）有29株、NADC30/NADC34樣毒株（亞型5）有115株以及分離于新疆地區的毒株（亞型9）有6株。進一步分析發現，除上述6種已發表的基因亞型外，又出現幾個與之明顯不同的分支，將其分別命名為亞型6（32株）、亞型7（4株）、亞型8（23株）。

2.2 不同基因亞型PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列對比

根據文獻報道，當前PRRSV2 GP5蛋白中存在1個信號肽、2個高變區（HVR1和HVR2）、3個跨膜區（TM1、TM2和TM3）以及5個表位結構（DE、NE、T1、T2、TM3），另有位于第13位和151位氨基酸位點的2個毒力相關位點[6，14-15]。本試驗從PRRSV1和PRRSV2毒株1～5基因亞型中隨機選取代表毒株與本試驗獲得的98株代表性分析毒株的GP5蛋白氨基酸序列進行對比分析。結果表明，中國PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列中普遍存在變異。相比于PRRSV2的代表毒株VR-2332、PRRSV1毒株和亞型7均在第33～34位氨基酸位點處插入2個氨基酸;相比于PRRSV1的代表毒株，亞型6和亞型7分別在第34位氨基酸位點、58位氨基酸位點處出現1個氨基酸缺失。而Genotype 1和Subgenotype 7毒株均在33～34位氨基酸位點處插入2個氨基酸，其余的突變主要表現為各氨基酸位點的點突變。

2.3 PRRSV ORF5基因的重組分析

重組分析共檢測到11個重組事件，其中，2個是明確的重組事件，9個是潛在的重組事件[16-18]。在明確的重組事件中，重組事件2的重組體是毒株MH422060（NCBI登錄號：HLJ/HEB/2016/1031b），其主要親本是毒株KX815428（NCBI登錄號：15SC3），次要親本是毒株MK450614（NCBI登錄號：2018113Zhangshu6），重組區域大約發生在ORF5基因序列的270～570 bp。

3 討論

近年來，中國陸續報道新的突變毒株，使得中國的PRRSV流行毒株更加多樣化，變異進程加快，防控更加復雜化[16，19-21]。雖然中國已采取疫苗免疫的方法進行防控，但高致病性毒株減毒活疫苗的無序使用造成減毒活疫苗病毒的大量傳播，使得PRRS仍然是嚴重危害中國養豬業的重要疫病之一[22]。通過對PRRSV基因組特征和遺傳進化分析發現，基于選擇壓力的變化和病毒自身進化的需要，PRRSV不斷發生變異和重組，尤其是在NSP2和GP5? 2個最易變異的蛋白質上面，這給PRRS的防治帶來了更大困難，因此PRRSV NSP2和ORF5基因也常被用作PRRSV各流行毒株間遺傳進化分析的靶基因。

通過對新鑒定亞型進行地理區分分析，我們發現以KY373214、MF133296等為代表的新亞型6主要在廣西、河南、四川、山東等地被檢出;以KC527830、KX815419為代表的新亞型7主要在廣東、浙江等地被檢出;以MK291407、KP998415為代表的新亞型8主要在中國臺灣地區被檢出，且新亞型6與PRRSV1，新亞型7與lineage 3，新亞型8與lineage 1親緣關系較近，表明目前中國的 PRRSV呈現多基因亞型并存的局面，且基因亞型的種類有進一步增多的趨勢。

通過對PRRSV ORF5基因編碼蛋白質的變異分析發現，其存在多處點突變，個別基因型或基因亞型還存在堿基插入和缺失的情況，該情況可能導致已有的PRRSV疫苗免疫效果不佳或失敗，更可能導致新型變異毒株的出現。此外，與毒力有關的第13位和第151位氨基酸位點的比對結果顯示，這些毒力位點的突變有可能會導致PRRSV流行毒株毒力的改變，甚至會出現新的高致病性毒株。

對PRRSV ORF5基因的重組分析結果表明，基于中國不同地區的877株PRRSV ORF5基因共檢測到11個可能的重組事件，但是根據Tomitaka等[18]和Li等 [16]的結果判斷原則，其中只有2個是明確的重組事件，雖然重組事件1中重組體MK689083（新亞型6）的主要親本尚不明確，但其次要親本MT036931卻是亞型4，即高致病性PRRSV減毒疫苗毒株或演化毒株。重組事件2中的重組毒株MH422060（亞型2，即經典毒株）來源于KX815428（亞型5，即NADC30-like毒株）和MK450614（亞型1，即高致病性毒株）的重組，這與陳盛楠等[14]和Xie等[19]對中國部分地區PRRSV變異分析的結果一致，說明中國PRRSV毒株間的重組頻頻發生是導致新的突變毒株出現的主要原因之一。特別值得注意的是，雖然利用RDP4軟件并未檢測到PRRSV1與PRRSV2毒株之間存在基因重組的情況，但通過氨基酸序列比對發現，亞型7的第1～56個氨基酸與PRRSV2代表株高度同源，其第62～201個氨基酸卻又與PRRSV1代表株高度同源，提示亞型7可能來源于PRRSV1與PRRSV2毒株間的基因重組。眾所周知，基因重組可能會導致病毒的抗原表位發生變化，從而導致病毒發生變異，這既是病毒發生變異產生新的亞群的一種方式，也是疫苗特異性免疫失敗的一個重要原因[23]。對重組事件進一步分析發現，所收集877株PRRSV ORF5基因的重組情況主要分布在廣東、吉林、河南、浙江、江西、黑龍江、安徽等地，其中在河南檢出最多，其次是山東，提示將來這些地方的PRRSV防控應以重組毒株為主。

本研究基于877株中國2010-2019年 PRRSV ORF5基因序列對中國近年來PRRSV流行毒株的變異情況進行了分析，本研究結果為進一步研究中國PRRSV的遺傳演化，篩選新的疫苗候選株和開發新型疫苗防控PRRS具有重要意義。

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（責任編輯：陳海霞）

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