果樹中花色苷的生物合成及其調控機制研究進展

高磊　李慧　鄭煥　陶建敏

摘要： 花色苷是一種多酚類水溶性色素，在合成過程中不僅受到多種酶的催化，還受到外界環境因素、內源激素以及多種轉錄因子的調節。研究果樹植物中花色苷的生物合成及其調控機制有利于進一步探索果樹植物在自然和應激條件下葉片、花、果實等著色的機制，明確轉錄因子與結構基因間的互作關系，幫助人們在育種與生產上最大程度地利用花色苷來提高果樹植物的抗逆性與產品價值。本文綜述了果樹中花色苷的生物合成及其調控機制。

關鍵詞： 花色苷;生物合成;分子調控

中圖分類號： Q946.83 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0258-10

Abstract： Anthocyanin is a polyphenolic water-soluble pigment. The biosynthesis of anthocyanins is not only catalyzed by a variety of enzymes， but also regulated by external environmental factors， endogenous hormones and transcription factors. Studying the biosynthesis and regulation mechanism of anthocyanins in fruit trees is helpful to further explore the coloring mechanism of leaves， flowers and fruits under natural and stress conditions， clarify the interaction between transcription factors and structural genes， and help people make the most of anthocyanins in breeding and production to improve the stress resistance and product value of fruit trees. This paper reviews the biosynthesis and regulation mechanism of anthocyanins in fruit trees.

Key words： anthocyanins;biosynthesis;molecular regulation

1 花色苷的概念及作用

花色苷是一種極其重要的多酚類水溶性色素，在結構上通過糖苷鍵將花色素和糖類結合起來，因此可以相對穩定地存在于植物細胞液泡中[1]。它含有一個含氧雜環和兩個芳香環，所以本質上是一種黃酮類化合物，但它又和天然的黃酮類化合物有所不同，因其特殊的紫外吸收峰和強烈吸收可見光等特點，人們可以利用高效逆流色譜法對它進行純化[2]。當前主流的提取花色苷的方法有超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓輔助提取法等，目前已經有500多種花色苷被人工提取出來，在植物中花色苷主要以錦葵素（Malvidin）、矮牽牛素（Petunidin）、矢車菊素（Cyanidin）、飛燕草素（Delphinidin）、芍藥素（Peonidin）、天竺葵素（Pelargonidin）這六種形態存在[2]。

花色苷廣泛分布在園藝植物的根、莖、葉、果實、花和種子等器官的細胞的液泡中，不僅可以賦予植物色彩，還在植物體內承擔著抵抗不良自然環境（如低溫脅迫、病蟲侵染、干旱）以及避免光合機構被強光和紫外線破壞等重要作用[3-4]。在人體中它還具有很強的抗氧化、抗炎、調節血脂以及人體胰島素含量等多種作用，對人體有著重要的保護功效。目前已經被廣泛應用到食品加工、醫療和保健品加工等行業中[5-6]。因此研究花色苷的生物合成及其分子調控機制不僅有利于深入了解花色苷的生物合成途徑，還有利于了解植物在自然和應激條件下生成花色苷的信號調控與各種基因之間的互作關系。

2 花色苷的生物合成代謝

花色苷在植物體內的合成主要由一系列結構基因所調控（圖1），這些結構基因通過編碼不同功能的酶來參與花色苷的合成。花色苷的生物合成可以大致分為苯丙烷代謝途徑、類黃酮代謝途徑和花色苷合成修飾途徑這三個階段（圖1）[7]。

第一個階段中以苯丙氨酸和乙酸作為黃酮類物質的直接合成前體，在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）和乙酸-CoA羧化酶的參與下合成4-香豆酰CoA和丙二酰CoA這兩個底物[8]。在第二階段中上述兩個底物首先在查耳酮合酶（CHS）的催化下發生縮合反應，合成四羥基查耳酮，進而在查耳酮異構酶（CHI）催化下生成合成類黃酮的直接前體物質——柚皮素，隨后在黃烷酮3-羥化酶（F3H）催化下生成羥基化產物二氫黃酮醇。二氫黃酮醇可以在類黃酮3′5′羥化酶（F3′5′H）、類黃酮3′羥化酶（F3′H）的催化下發生不同程度的羥基化反應，分別合成二氫楊梅黃酮和二氫櫟皮酮。第三階段利用二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）的選擇性催化特性將上述3種二氫黃酮醇還原為無色且不穩定的花色素，再利用花色苷合酶（ANS）脫水氧化生成有色不穩定的飛燕草素、天竺葵素和矢車菊素這三類花色素[9-11]。然后通過類黃酮-3-葡糖基轉移酶（UFGT）將葡萄糖轉移到花色素分子的羥基上生成糖苷鍵，糖基化可顯著提高花色素的穩定性，避免花色素向液泡轉移的過程中被降解[12]。這三類花色苷隨后通過甲基化、酰基化等修飾生成藍紫色的錦葵素、磚紅色的花葵素和紫紅色的芍藥素。花色苷在內質網中合成后，隨即通過囊泡運輸與谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、多藥毒性排除轉運體（MATE）、ATP-結合盒（ABC） 等轉運蛋白運輸到液泡中保存[13]。

3 外界環境與植物激素對花色苷生物合成的影響

3.1 外界環境對花色苷合成的影響

花色苷的生物合成會受到外界各種環境因素的影響，其中溫度與光照是主要的影響因素[14]。溫度可以通過影響花色苷合成相關酶的活性來間接影響花色苷的合成[15-17]。在高溫條件下，花色苷合成相關酶的活性下降，抑制了花色苷的合成，同時花色苷穩定性被破壞，最終導致花色苷含量大大降低[18]。例如海棠（Calophyllum inophyllum L.）果實在高溫處理后，MpCHS、MpDFR、MpUFGT等結構基因表達量顯著降低，花色苷含量降低[19]。在石榴（Punica granatum L.）中比較0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃下果肉內花色苷的穩定性，結果顯示15 ℃下花色苷的穩定性最差且隨著貯存時間的延長含量明顯降低[20]。荔枝（Litchi chinensis Sonn.）果皮在高溫下會由正常的紅色迅速變為褐色，這表明高溫會促使花色苷降解，果皮中花色苷合成關鍵基因LcUFGT的表達也會受高溫抑制，阻礙了果皮中花色苷的合成與積累[21]。蘋果（Malus domestica）中的熱激轉錄因子MdHSF3b/4a受高溫誘導會與轉錄抑制因子MdBBX24啟動子中的熱激響應元件HSE特異性結合，并促進其表達，進而抑制花色苷的合成，結果表明高溫可以通過刺激轉錄抑制因子的表達抑制花色苷的合成[22]。

對于大部分果樹植物來說，低溫往往更有利于花色苷的積累[23]。將秋皇后盆栽葡萄（Vitis vinifera L.）分別在20 ℃和30 ℃下處理，與30 ℃的對照相比20 ℃下果皮中花色苷的積累量以及相關基因的表達量顯著提高[24]。海棠葉片在低溫誘導下，McbHLH3/33、McMYB10和McTTG1表達量會明顯升高，使葉片著色加深[25]。蘋果果實經低溫處理后轉錄因子MdMYBA會增強結構基因MdANS啟動子的活性，進而促進花色苷的合成[26];低溫還可以誘導磷酸化修飾后的MdbHLH3結合在MdBBX20啟動子中的低溫響應原件（LTR）上[22]，促進下游結構基因MdDFR、MdUFGT的表達，進而促使果實著色[27]。低溫會影響花色苷的組織特異性積累，如血橙（Citrus sinensis）的果皮與果肉都可以積累花色苷，而紫色柚[Citrus maxima （Burm） Merr.]只能在果皮中積累花色苷[28]。紫色柚果肉的CgRuby1啟動子中缺乏E-box元件，不具有感受低溫的能力也無法與bHLH結合，故無法在低溫下積累花色苷[29-30]。

光照可以通過光質、光照度與光照時間影響花色苷的生物合成[31]。其中光質主要通過UV-B信號通路來參與植物花色苷的合成，波長為280～320 nm的UV-B對花色苷合成的影響最大[32]。HY5與COP1是UV-B信號途徑的兩個關鍵光信號轉錄因子[33]，在黑暗下COP1可以將HY5泛素化降解，導致花色苷合成受阻[34]。在光照下，UV-B信號會刺激其光信號受體UVR8由無活性的二聚體構型變為活性的單體構型并形成UVR8-COP1蛋白復合體，解除了COP1對HY5的降解，從而激活花色苷的生物合成[35-36]。血橙與紫色柚在光誘導下，HY5可以直接結合并激活Ruby1啟動子的G-box-1（CACGTC）元件，進而積累花色苷[28]。蘋果中MdDFR和MdUFGT的啟動子中的光響應元件在光下可以與bZIP因子或bHLH結合成光響應復合體，提高果實對光照的敏感性[37]。處于強光下的蘋果果實，花色苷合成相關基因的表達量與遮光果實相比明顯升高，其中MdMYB1的表達量升高了20～25倍[38]。草莓（Fragaria ananassa Duch.）果實中的FaDFR、FaANS、FaUFGT和FaMYB10等花色苷合成相關基因的表達量與光照度呈正相關，強光下果實中花色苷含量顯著增加[39]。在海棠葉片中，隨著光照時間的延長，黃酮類物質含量、葉片著色程度以及花色苷合成基因的表達都明顯增加[40]。

3.2 植物激素對花色苷合成的影響

激素對植物的生長發育具有顯著的調控作用，可以影響植物體中包括花色苷在內的各種次生代謝物質的生成[41-42]。生長素（IAA）主要通過植物體內的ARF-Aux信號通路影響植物的生長發育[43]。其中ARF基因是主要的生長素響應基因，可以對花色苷的生物合成起到明顯的抑制作用[44]。 如在蘋果中，MdARF13基因可以與MdDFR的啟動子結合抑制MdDFR的表達，繼而抑制花色苷的生物合成[45]。在蘋果上施加生長素類似物2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）可以促進ARF基因的表達，抑制MdMYB10和MdbHLH3對結構基因的調控[46]。細胞分裂素對花色苷的影響與生長素相反，它可以促進受糖誘導的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose）基因以及類黃酮-O-葡萄糖基轉移酶（UF3GT）基因的表達來促進花色苷的合成[47-48]。用低濃度的細胞分裂素類似物6-芐基腺嘌呤（6-BA）處理美樂葡萄，可以增強VvF3′5′H、VvANS、VvUFGT等基因的表達來合成花色苷[49]。脫落酸（ABA）是植物主要的抗逆激素，可以通過關閉植物氣孔、提高根系對水分的吸收能力來幫助植物抵御逆境，同時促進植物中花色苷的生物合成[50-51]。用ABA處理夏黑葡萄可以使果皮中的錦葵素糖苷與矮牽牛素糖苷含量明顯增加[52]，促進果皮中CHS3和UFGT等結構基因的表達[53-54]。油菜素內酯（BRs）是一種新型的植物內源激素，在提高植物產量，提高抗逆性等方面有重要作用[55]。用BRs處理赤霞珠葡萄可以提高果皮中PAL、UFGT等酶的活性，同時刺激內源ABA的合成促進果皮著色[56];在巨峰葡萄上噴施BRs可以降低高溫對葡萄花色苷合成的抑制作用并促進果實著色[57]。茉莉酸（JA）對花色苷的合成也具有促進作用，它可以刺激花色苷合成上游結構基因苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的表達來促進花色苷合成[58]。在美樂葡萄葉面噴施茉莉酸甲酯（MeJ），使果皮中花翠素類花色苷含量顯著升高[59]。在蘋果中，JA可以誘導MdMYB24L表達，增強下游結構基因MdDFR、MdUFGT的啟動子活性來誘導花色苷合成[60]。

4 轉錄因子及其復合物對花色苷合成與結構基因的影響

4.1 MYB轉錄因子與結構基因的互作

MYB轉錄因子廣泛存在于高等植物中，是植物中最大的轉錄因子家族之一，N端存在的高度保守的功能性DNA結合域通常由1～3個的重復序列（R1、R2和R3）組成[61]。這些重復序列由間隔排列的色氨酸殘基組成，色氨酸殘基在每個重復序列的疏水核中形成簇，并起到穩定DNA結合結構域的作用[62]。

R2R3-MYB轉錄因子通過刺激花色苷合成途徑中重要結構基因的表達或與其他調控基因配合來促進植物體中花色苷的合成[63-64]。例如在獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）中，AcMYB10通過與AcbHLH42互作可以促進其下游結構基因AcLDOX、AcF3GT表達，來促進花色苷的生物合成[65]。在蘋果中，MdMYB1可以直接與MdGSTF6的啟動子結合促進花色苷向液泡中轉移[66]。在葡萄和桃等植物中也已發現R2R3-MYB有類似的作用[67-69]。

R3-MYB在結構上只含有單個R3重復序列且缺乏轉錄激活域，是花色苷合成途徑中重要的轉錄抑制因子[70]。一方面它通過抑制MBW對花色苷合成結構基因的調控來阻礙花色苷的合成。例如在番茄中，過表達的SlMYB-ATV（R3-MYB）可以與SlAN1和SlJAF13（bHLH）結合，充當MBW的競爭性抑制劑來阻礙花色苷的合成[71]。另一方面，它可以直接抑制結構基因的表達，來抑制花色苷的生成。例如在蘋果中，MdMYB16可以與下游結構基因MdANS和MdUFGT的啟動子結合，來抑制花色苷的合成[72];MdMYB6可以抑制MdANS和MdGSTF12的表達，還可以減少花色苷合成底物UDP-glu和UDP-gal的量來間接抑制花色苷的合成[73]。此外R3-MYB還通過抑制其他轉錄因子對結構基因的調節來間接阻礙花色苷的生成。在秋姬李中R3-MYB會抑制其他正調控轉錄因子如PsMYB10.1和PsbHLH3對花色苷合成基因PsDFR、PsANS的促進效果來阻礙花色苷合成[74]。

MYB轉錄因子還可以通過突變來影響花色苷的合成。在白色葡萄中，VvMYBA1的啟動子中插入了一個反轉座子，VvMYBA2蛋白的氨基酸序列上保守性極強的第44位精氨酸突變成了亮氨酸[75-76]，mRNA編碼區兩個核苷酸（C、A）的缺失等[77]。這些突變最終使VvMYBA1/A2無法對VvUFGT進行調控，進而使果肉無法積累花色苷[78-79]。在血橙中，CsRuby1的啟動子中插入了一個含有低溫響應元件LTR的反轉錄轉座子（Tcs1），使血橙在低溫誘導下積累花色苷[28]。

4.2 bHLH轉錄因子與結構基因的互作

bHLH轉錄因子是由60個氨基酸組成的螺旋-環-螺旋結構，并且形成了兩個不同的功能域[80]。一個是基本的DNA結合域，此結構域賦予其結合DNA的能力，并且可以特異性識別目標基因上的E-box基序（CANNTG），另一個是通過疏水性氨基酸二聚化的HLH區域[81-82]。

在大部分植物中bHLH轉錄因子往往與MYB互作，在MYB的參與下調控結構基因的表達來影響花色苷的合成。例如蘋果中MdbHLH33能夠與轉錄抑制子MdMYB16互作形成異源二聚體，抑制MdMYB16與下游結構基因啟動子結合，進而保證花色苷的正常合成[83]。在葡萄中，VvMYC1通過HLH區域形成二聚化結構，與VvMYBA1/A2互作，共同促進VvCHI、VvANR和VvUFGT等基因的表達促進花色苷合成[84]。此外VvMYC1與VvMYBA1組成的轉錄復合物還可以激活VvMYC1自身啟動子的活性產生正反饋調節效應[85]。此外bHLH還可以直接調控結構基因的表達來影響花色苷的生成。在藍果忍冬（Lonicera caerulea L.）中，LcTT8可以促進下游結構基因LcDFR、LcANS的表達而積累花色苷[86]。在蘋果中，MdbHLH3可以直接刺激MdDFR、MdUFGT等結構基因的表達，來促進花色苷的合成與積累[87]。

4.3 WD40轉錄因子與結構基因的互作

WD40重復序列第一次在異源三聚體G蛋白和CDC4蛋白的Gβ亞基中得到鑒定，長度約為43個氨基酸，包括N端的Gly-His（甘氨酸-組氨酸）和C端的Trp-Asp（色氨酸-天冬氨酸）組成的高度保守的二肽結構，這些保守殘基形成的強大氫鍵網絡可以穩定WD40的折疊結構[88-89]。

WD40轉錄因子可以通過自身40個氨基酸組成的四鏈反平行β折疊結構直接與其他轉錄因子互作。例如蘋果中的WD40蛋白MdTTG1雖然不能與MYB轉錄因子相互作用，但是可以與MdbHLH3/33互作來調節花色苷的合成[90]。WD40轉錄因子也可與MYB和bHLH共同組成MBW轉錄復合物，在其中承擔著穩定復合物結構、提供蛋白質間互作平臺的作用[91]。在石榴中，PgTTG1能與PgAn2（MYB）和PgAn1（bHLH）組成MBW復合物來調節PgANS和PgDFR的表達，從而促進花色苷的積累[92-93]。

4.4 MBW轉錄復合物

植物中花色苷的生物合成主要受到MBW（MYB-bHLH-WD40）轉錄復合物的調控（表1）[94]。轉錄復合物中的各個組分具有不同功能，如轉錄因子MYB和bHLH通過DNA結合域與下游結構基因的啟動子結合來調控基因表達，而WD40蛋白則負責轉錄復合物結構的穩定[95]。在大部分果樹植物中，MBW轉錄復合物往往通過調控CHS、DFR、ANS和UFGT等花色苷生物合成相關結構基因的表達來參與花色苷的合成。在楊梅[Myrica rubra （Lour.） S. et Zucc.]中，MrMYB1-MrbHLH1-MrWD40-1轉錄復合物可以促進MrDFR、MrUFGT等結構基因的表達積累花色苷[96]。上述結果在草莓、石榴等果樹植物中均已得到驗證[93，97-99]。

有時轉錄因子MYB與bHLH可以組成二元復合物來單獨調控花色苷的合成。如楊梅中的MrMYB1與MrbHLH1共表達時可明顯提高MrCHS、MrANS、MrUFGT等基因的表達量來促進花色苷合成[100]。在荔枝中，LcMYB1與LcbHLH3組成二元復合物也可以促進下游LcDFR，LcANS等基因的表達來促進果皮著色[101]。在甜櫻桃[Cerasus avium （L.） Moench.]中，PacMYBA通過與PacbHLH相互作用，共同激活下游基因PacDFR、PacANS和PacUFGT的表達來提高果實中花色苷的含量[102]。

4.5 其他轉錄因子與結構基因的互作

MYB、bHLH、WD40三大轉錄因子家族是參與花色苷生物合成的主要調節因子，此外其他轉錄因子如WRKY、HY5、NAC、B-box對花色苷的合成調節也有著不可忽視的作用[103-104]。它們可以通過相互作用組成復合物，調節MYB、bHLH或WD40等轉錄因子的表達來間接調節花色苷的合成。如蘋果中MdWRKY72與MdWRKY11可以與MdHY5啟動子中的W-box元件結合來促進MdMYB1的表達，繼而促進花色苷積累[105];MdBBX20的G-box結構域可以與MdHY5的b-ZIP結構域相互識別結合形成MdBBX20-MdHY5蛋白復合體，激活MdMYB1啟動子的活性來促進下游結構基因的表達[106]。在紅肉桃（Amygdalus persica L.）中，NAC轉錄因子BL與PpNAC1組成的二元復合物可以促進PpMYB10的表達來促進花色苷合成[107]。

WRKY、HY5與NAC等轉錄因子可以直接與MYB、bHLH或WD40相互作用調控花色苷的合成。例如紅皮梨[Pyrus pyrifolia （Burm. F.） Nakai]中PyWRKY26可以直接激活PyMYB114的啟動子活性，促進PyMYB114對下游結構基因的調控，進而積累花色苷[108];PyHY5可以直接識別并結合PyMYB10和PyWD40啟動子中的G-box序列刺激它們表達，進而促進花色苷的合成[109]。在蘋果中，MdbZIP4可以直接結合到MdMYB114的啟動子上，促進MdANS、MdUFGT等結構基因的表達而促進花色苷的合成[110];MdWRKY41可以與MdMYB16（R3-MYB）互作來抑制下游MdANS、MdUFGT等基因的表達，進而抑制花色苷的合成[111];MdNAC42/52可以直接激活MdMYB9/10/11的啟動子來促進花色苷的合成[112]。

B-box、NAC和WRKY等轉錄因子可以直接調控結構基因的表達來影響花色苷的合成。蘋果中B-box轉錄因子MdBBX24可以抑制下游結構基因MdDFR、MdANS啟動子的順式作用元件活性來抑制花色苷的合成[22];MdWRKY40可以直接結合MdANS啟動子的W-box與MRE元件，促進MdANS的表達而積累花色苷[113];過表達MdNAC42可以使結構基因MdDFR、MdANS、MdUFGT表達量顯著提高，促使果色加深[114]。荔枝中LcNAC13會抑制LcCHS、LcCHI、LcDFR和LcMYB1等花色苷合成相關基因的表達而阻礙花色苷的合成[115]。草莓中AP2轉錄家族中的FaABI4可以直接促進FaCHS和FaUFGT等基因的表達，進而促進草莓中蔗糖與花色苷的積累[116]。因此WRKY、HY5、NAC、B-box等轉錄因子與MYB、bHLH、WD40三大轉錄因子家族組成龐大的調控網絡來共同調控花色苷合成結構基因的表達，進而參與花色苷的合成調控（圖2）。

5 展望

近年來對果樹中花色苷的研究已經取得了很大進展，基本闡明了花色苷在果樹中的合成途徑以及參與的各種結構基因，同時在葡萄、蘋果、柑橘等植物中也基本闡明了轉錄因子與結構基因的各種互作關系。轉錄因子在花色苷合成的調節中具有重要作用，其中MYB、bHLH、WD40這三大類轉錄因子家族起主要作用，它們可以單獨或組成MBW轉錄復合物參與合成調節，另外WRKY、HY5、NAC、B-box等轉錄因子也可以與MYB、bHLH、WD40相互作用參與花色苷的合成。

未來人們可以利用基因編輯技術[117-118]選擇性地合成某種花色苷，從而起到定向影響果皮或者花朵著色的效果。例如向某種不含花色苷合成結構基因的植物轉入關鍵基因使其獲得新的性狀，或者導入外源轉錄因子基因定向調節內源結構基因的表達和次生代謝物的合成。也可以利用基因敲除技術[119]沉默某一基因的表達來改變植物的花色等。盡管花色苷合成的研究已經取得了諸多的成就，但是像花色苷合成途徑在不同的植物組織或器官表達的唯一性、結構基因表達的時間順序與空間位置、轉錄因子與結構基因的作用位點等問題還有待探索，相信未來人們可以構建更為清晰的花色苷合成網絡，探索合成途徑中關鍵酶的晶體結構，利用基因工程和生物信息學等技術為創造和改變花色提供更為清晰思路和前景。

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（責任編輯：蔣永忠）

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