侗族腌魚發(fā)酵過程中生物胺與游離氨基酸的相關性

趙 鳳， 楊宏榮， 王賢文， 才讓卓瑪， 曾詩雨，楊 星， 張美彥， 趙振新， 張效平

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術中心，貴州 貴陽550025；3.錦屏縣市場監(jiān)督管理局，貴州 錦屏 556700； 4.赫章縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 畢節(jié) 553207)

0 引言

【研究意義】腌魚是貴州黔東南苗族侗族自治州的傳統(tǒng)發(fā)酵魚產(chǎn)品，也是地理標志產(chǎn)品，其味道鮮美，口感軟嫩，可直接食用，也可蒸、炸后食用，是當?shù)鼐用裾写腿说拿牢都央萚1]。東南亞和非洲等地也有發(fā)酵魚產(chǎn)品的制作與食用[2-3]。傳統(tǒng)發(fā)酵魚在自然條件下經(jīng)微生物的發(fā)酵作用而成，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生生物胺類物質(zhì)，過量則會導致頭暈惡心及中毒[4-5]。發(fā)酵肉制品中，生物胺的積累主要是環(huán)境中的微生物通過氨基酸脫羧反應或胺化作用下進一步分解形成[6-7]，而游離氨基酸的產(chǎn)生主要是通過微生物將蛋白質(zhì)分解成短肽，然后肽在酶的作用下形成[8-9]。因此，弄清發(fā)酵魚產(chǎn)品中生物胺和游離氨基酸的相關性，對腌魚制作過程中的發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵工藝及產(chǎn)品的質(zhì)量調(diào)控具有重要意義。【前人研究進展】近年來，關于發(fā)酵魚制品的研究主要集中在風味形成機制、影響因素等方面。JIANG等[10]研究表明，不同品種魚類制備的傳統(tǒng)發(fā)酵魚露產(chǎn)生的風味物質(zhì)含量不同。ZENG等[11]研究了添加鹽對發(fā)酵魚產(chǎn)品風味的影響。KANNO等[12]研究了添加微生物對發(fā)酵魚露風味品質(zhì)的影響。【研究切入點】未見關于侗族腌魚發(fā)酵過程中生物胺與游離氨基酸的相關性的研究報道。以傳統(tǒng)發(fā)酵腌魚為研究對象，采用高效液相色譜法研究腌魚整個發(fā)酵階段的生物胺和游離氨基酸的相關性。【擬解決的關鍵問題】探明腌魚整個發(fā)酵階段的生物胺與游離氨基酸的相關性及生物胺的形成機理，以期為腌魚生產(chǎn)的發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵工藝及產(chǎn)品的質(zhì)量調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試魚 稻田綜合種養(yǎng)高背鯉魚，由貴州裕和農(nóng)產(chǎn)品有限公司養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機，美國熱電儀器公司生產(chǎn)；高效液相色譜，美國Waters公司生產(chǎn)；精密電子天平，梅特勒-托利多公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及工藝流程 取鮮活的稻田養(yǎng)殖高背鯉魚從背部剖開，去內(nèi)臟，用水沖洗干凈，鹽腌2～3 d，瀝干水分至60%左右，各種香辛料(辣椒、花椒、姜等)與發(fā)酵的糯米攪拌均勻，裹到魚腹內(nèi)，在容器的底部鋪上部分糯米，按1層魚1層糯米粉，壓緊，頂部鋪上1層糯米后夯實，加蓋，封嚴，自然條件下發(fā)酵35～42 d，pH至4.1～4.4即發(fā)酵成熟。工藝流程為新鮮鯉魚→宰殺→腌制→發(fā)酵→成品。

1.2.2 樣品采集 選擇新鮮、腌制、發(fā)酵10 d、發(fā)酵20 d、發(fā)酵30 d、發(fā)酵40 d和發(fā)酵50 d 7個時期的腌魚樣品，為縮小個體間的差異，采集背部肌肉作為研究樣品；3次重復。

1.2.3 指標檢測 利用高效液相色譜技術檢測腌魚傳統(tǒng)發(fā)酵過程中生物胺和游離氨基酸的含量。

1) 生物胺。取 5 g絞碎的魚肉于50 mL離心管中，參照文獻[13]的方法進行前處理。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：35℃；進樣量5 μL，波長254 nm，流動相A為5 mmol/L乙酸銨，流動相B為乙腈；流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 生物胺的梯度洗脫程序

2) 游離氨基酸。分別取新鮮樣品及冷凍樣品2 g加入15 mL質(zhì)量分數(shù)15%的三氯乙酸，勻漿，靜置2 h，10 000 r/min離心15 min，取離心后的液體，5 mL用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 2.0，然后定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm膜后上機測定，3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行處理與相關性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌魚發(fā)酵過程中的生物胺含量

從表2看出，新鮮魚肉中不同生物胺含量及總胺含量均較低，各生物胺含量為1.34～12.80 mg/kg，總胺含量為46.69 mg/kg；腌制后魚肉中不同生物胺含量及生物胺總量升高，各生物胺含量為2.68～30.22 mg/kg，生物胺總量為95.72 mg/kg。發(fā)酵10～50 d，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺和總胺含量分別為20.35～55.12 mg/kg、10.66～15.32 mg/kg、45.39～59.63 mg/kg、35.18～65.13 mg/kg、8.99～12.31 mg/kg、51.21～99.15 mg/kg、4.32～6.02 mg/kg、5.18～5.89 mg/kg和181.38～318.57 mg/kg；各生物胺及總胺含量均隨著發(fā)酵時間的延長呈先升后降趨勢，均在發(fā)酵30 d時達最高。表明，隨著發(fā)酵時間的延長微生物的活動增強，尤其是具有氨基酸脫羧酶的微生物，發(fā)酵30 d至發(fā)酵結(jié)束階段生物胺的含量下降可能是產(chǎn)生物胺氧化酶的微生物開始活躍所致。

表2 侗族腌魚發(fā)酵過程中的生物胺含量

2.2 腌魚發(fā)酵過程中游離氨基酸的含量

從表3可知，侗族腌魚發(fā)酵過程中15種游離氨基酸的含量變化。天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量：從腌制至發(fā)酵40 d呈上升趨勢，發(fā)酵40 d時升至最高，分別為165.09 mg/100g、122.50 mg/100g、86.46 mg/100g、295.65 mg/100g和129.53 mg/100g，之后下降。蘇氨酸和谷氨酸含量：從腌制至發(fā)酵30 d呈上升趨勢，發(fā)酵30 d時升至最高，分別為163.93 mg/100g和106.85 mg/100g，之后降低。絲氨酸含量：從腌制至發(fā)酵10 d升至最高，為17.67 mg/100g，發(fā)酵40～50 d未檢出。丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量：從腌制至發(fā)酵成熟時一直呈上升趨勢，即至發(fā)酵50 d時升至最高，分別為361.29 mg/100g、171.89 mg/100g、216.51 mg/100g和118.34 mg/100g。賴氨酸、組氨酸和脯氨酸含量：從腌制至發(fā)酵20 d呈上升趨勢，發(fā)酵20 d時升至最高，分別為186.17 mg/100g、91.76 mg/100g和24.17 mg/100g，之后降低。

表3 侗族腌魚發(fā)酵過程中的游離氨基酸含量

2.3 腌魚發(fā)酵過程中生物胺與游離氨基酸的相關性

從表4看出，游離氨基酸含量與生物胺含量的相關性存在差異。其中，天冬氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈極顯著正相關，與苯乙胺、腐胺、組胺和亞精胺呈顯著正相關，與精胺呈正相關。蘇氨酸除與腐胺和精胺呈顯著正相關外，與其余生物胺和總胺均呈極顯著正相關。絲氨酸與全部生物胺和總胺均呈負相關。谷氨酸與苯乙胺、腐胺、亞精胺和精胺呈顯著正相關，與色胺、尸胺、組胺、酪胺和總胺呈正相關。甘氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關，與其余生物胺呈正相關。丙氨酸除與色胺呈顯著正相關外，與其余生物胺和總胺均呈正相關。胱氨酸、纈氨酸、賴氨酸和脯氨酸與全部生物胺和總胺均呈正相關。蛋氨酸與色胺呈極顯著正相關，與腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和總胺呈顯著正相關，與苯乙胺和精胺呈正相關。異亮氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關，與其余生物胺呈正相關。亮氨酸與色胺呈極顯著正相關，與尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關，與其余生物胺呈正相關。苯丙氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關，與其余生物胺呈正相關。組氨酸除與色胺和精胺呈顯著正相關外，與其余生物胺和總胺均呈極顯著正相關。

表4 腌魚發(fā)酵過程中生物胺與游離氨基酸的相關性

3 討論

發(fā)酵食品中生物胺的形成主要通過微生物的氨基酸脫羧及醛酮還原的作用產(chǎn)生[14]。研究結(jié)果表明，新鮮魚肉中不同生物胺含量及總胺含量均較低，各生物胺含量為1.34～12.80 mg/kg，總胺含量為46.69 mg/kg；腌制后魚肉中不同生物胺含量及生物胺總量升高，各生物胺含量為2.68～30.22 mg/kg，生物胺總量為95.72 mg/kg。各生物胺及總胺含量均隨著發(fā)酵時間的延長呈先升后降趨勢，均在發(fā)酵30 d時達最高。表明，隨著發(fā)酵時間延長微生物的活動增強，尤其是具有氨基酸脫羧酶的微生物，發(fā)酵30 d至發(fā)酵結(jié)束這一階段生物胺的含量下降可能是產(chǎn)生物胺氧化酶的微生物開始活躍所致。侗族腌魚發(fā)酵過程中酪胺、尸胺、腐胺和色胺是腌魚的主要生物胺，與已報道的鰱香腸發(fā)酵過程中的主要生物胺為腐胺、尸胺和酪胺[15]，發(fā)酵鱖魚中的主要生物胺為色胺、腐胺、尸胺和酪胺[16]研究結(jié)果相似。組胺、酪胺、β-苯乙胺和色胺影響魚的神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)[17]。尸胺、腐胺與亞硝酸鹽發(fā)生作用會產(chǎn)生具有強致癌作用的亞硝胺，也會使組胺的毒性增大[18]。

研究結(jié)果表明，在侗族腌魚發(fā)酵過程中，天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量從腌制至發(fā)酵40 d呈上升趨勢，均在發(fā)酵40 d時升至最高；蘇氨酸和谷氨酸含量從腌制至發(fā)酵30 d呈上升趨勢，均在發(fā)酵30 d時升至最高；絲氨酸含量從腌制至發(fā)酵10 d升至最高，發(fā)酵40～50 d未檢出；丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量從腌制至發(fā)酵成熟時一直呈上升趨勢，即至發(fā)酵50 d時升至最高；賴氨酸、組氨酸和脯氨酸含量從腌制至發(fā)酵20 d呈上升趨勢，發(fā)酵20 d時升至最高。酪氨酸和精氨酸在腌制階段未檢測到的主要原因：一是可能檢測方法的檢測限高，導致低含量的酪氨酸和精氨酸未檢測到；二是可能酪氨酸和精氨酸發(fā)酵開始時在微生物的作用下生產(chǎn)胺類物質(zhì)，發(fā)酵10 d時未檢測到酪氨酸和精氨酸。生物胺的前體物質(zhì)是游離氨基酸，有研究得出，精氨酸脫羧形成鳥氨酸，再脫羧成腐胺，或直接脫羧產(chǎn)生精胺和亞精胺；賴氨酸脫羧形成尸胺；組氨酸脫羧形成組胺；苯丙氨酸脫羧形成2-苯乙胺；酪氨酸脫羧形成酪胺等[19-20]。

研究結(jié)果表明，游離氨基酸含量與生物胺含量的相關性存在差異。其中，天冬氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈極顯著正相關，與苯乙胺、腐胺、組胺和亞精胺呈顯著正相關；蘇氨酸與除腐胺和精胺外的其余生物胺和總胺均呈極顯著正相關；絲氨酸與全部生物胺和總胺均呈負相關；谷氨酸與苯乙胺、腐胺、亞精胺和精胺呈顯著正相關；甘氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關；丙氨酸與色胺呈顯著正相關；蛋氨酸與色胺呈極顯著正相關，與腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和總胺呈顯著正相關；異亮氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關；亮氨酸與色胺呈極顯著正相關，與尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關；苯丙氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺呈顯著正相關；組氨酸除與色胺和精胺外的其余其物胺和總胺均呈極顯著正相關。表明，胺的形成除氨基酸的脫羧作用外，還有其他的生成方式，如醛酮的轉(zhuǎn)氨基作用[21]。與李東蕊等[22]的豆瓣醬中精氨酸與腐胺呈負相關性研究結(jié)果不一致。所以，適當?shù)目刂朴坞x氨基酸的含量也可以控制生物胺的產(chǎn)生。

生物胺的檢測方法常用的有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法和電分析法[8,23-24]。當前研究的熱點方法是生物傳感器法[25]和免疫分析方法[26]，雖然其檢測限準確，但是非特異性差，操作方法復雜，具有一定的局限性，且只針對一種或者幾種結(jié)構(gòu)相似的胺類進行測定。因此，經(jīng)綜合考慮，采用常規(guī)的液相色譜法檢測腌魚中生物胺，其前處理簡單而且可以同時測定8種生物胺。

4 結(jié)論

總生物胺含量與游離氨基酸總含量呈極顯著相關性，其中，天冬氨酸與色胺、尸胺、酪胺和總胺的相關性極顯著，蘇氨酸除與腐胺和和精胺外的其余生物胺和總胺的相關性極顯著，蛋氨酸和亮氨酸與色胺的相關性極顯著，組氨酸與除色胺和精胺外的其余生物胺和總胺的相關性極顯著。