RNAi介導的中華蜜蜂AcerOBP14觸角電位反應

趙淑果，彭 竹，黃 麗，劉苗苗，趙慧婷

（山西農業大學 生命科學學院，山西 太谷 030801）

昆蟲在漫長的進化中形成了靈敏的嗅覺感受機制，利用嗅覺確定食物來源，選擇產卵場地、同伴、配偶和找尋寄主及躲避天敵等。嗅覺能夠探測外界環境中的各種氣味分子，如信息素、植物花香及動物體表揮發物，對昆蟲的生存至關重要[1]。昆蟲主要通過觸角上分布的各種嗅覺蛋白執行不同功能來進行嗅覺識別，各種嗅覺蛋白相互聯系共同作用完成昆蟲嗅覺有關的生理活動，并引起昆蟲相應的行為反應。例如當昆蟲的觸角識別到空氣環境中各種氣味物質時，分布在感器淋巴液的氣味結合蛋白（odorant binging proteins，OBPs）會與氣味物質形成OBP-氣味物質的復合體并轉運到嗅覺感受神經元的樹突，這時就會激活在樹突膜分布的嗅覺受體（odorant receptors，ORs），最后將信號傳遞到中樞嗅覺系統引起昆蟲的相應行為[2]。除此之外，還有化學感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、感覺神經元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）和氣味降解酶（odorant degrading enzyme，ODEs）等[3]。OBPs 是一類可溶性蛋白，負責外界氣味分子與嗅覺受體之間的聯系，是嗅覺識別的關鍵蛋白[4]。1981年，VOGT等[5]用同位素標記法首次在多音天蠶（Antheraea polyphemus）雄性觸角的毛形感器淋巴液中發現了第1 個昆蟲氣味結合蛋白。目前 OBPs 已在鱗翅目[6]、鞘翅目[7]、雙翅目[8]、膜翅目[9]、直翅目[10]和半翅目[11]等11個目的50多種昆蟲中鑒定出800多個OBPs。

蜜蜂是一種群居的社會性昆蟲，屬于膜翅目（Hymenoptera）細腰亞目（Apocrita）蜜蜂科（Apidae）蜜蜂屬（Apis）[12]。它們與人類的生活息息相關，多種顯花植物都依靠蜜蜂授粉，在提高農作物產量的同時[13]，對生態系統平衡的維持也具有重要作用[14]。此外，蜜蜂還能為人類提供各種天然健康、營養豐富的蜂產品，如所熟悉且可食用的蜂蜜、蜂王漿、蜂花粉和蜂膠等[15]。蜂產品在增加人類日常飲食種類之外，對人的身體健康也有很大的益處[16]。中華蜜蜂（Apis cerana cerana）簡稱中蜂，是東方蜜蜂的一個亞種，是我國飼養的當家蜂種，因其具有適應低溫、飛行敏捷、嗅覺靈敏、善于采集零星蜜粉源，適合山區植物傳粉及抗螨抗病能力強等優點，深受廣大養蜂者的歡迎[17]。

目前，中華蜜蜂氣味結合蛋白的研究已經從基因水平深入到蛋白水平，利用基因克隆、重組蛋白原核表達與純化、熒光競爭結合及RNA 干擾等技術揭示了氣味結合蛋白的功能。山西農業大學蜜蜂研究團隊前期克隆獲得了AcerOBP14基因序列，采用生物信息學軟件分析了其序列特征，采用qRT-PCR 分析了時空表達模式[18]；成功構建了Pet28a/AcerOBP14原核表達載體，誘導表達出重組蛋白，通過熒光競爭結合試驗鑒定了AcerOBP14重組蛋白對13種配體物質有較強的結合能力[19]。

基于前期熒光競爭結合試驗的結果，本研究通過飼喂法對中蜂采集蜂AcerOBP14基因干擾前后進行qRT-PCR 及觸角電生理試驗，旨在為以后深入研究中蜂嗅覺識別機制提供理論參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試中華蜜蜂飼養在山西農業大學的蜂場。于8：00—10：00 在無分蜂、無病、群勢強的中蜂巢門口隨機捕抓后足攜帶花粉的采粉蜂，用消毒鑷輕輕夾住中蜂采粉蜂胸部，放至木盒中，之后將木盒置于溫度為（28±1）℃、濕度為75%±5%的恒溫恒濕培養箱中。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑Trizol 購自美國Invitrogen 公司；T7 RiboMAX TM Express RNAi System 購自美國Promega 公司；熒光定量試劑盒2×Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）購自北京聚合美生物科技有限公司；cDNA 合成試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser 購自美國Omega Bio-Tek 公司；DNA 凝膠回收試劑盒Omega DNA Gel Extraction Kit 購自美國Omega Bio-Tek 公 司 ；D2000 DNA marker Ladder、核 酸 染 料GoldView、RNase-free water購自北京索萊寶科技有限公司；50×TAE Buffer購自生工生物工程（上海）有限公司；氣味標品均購自阿拉丁試劑有限公司。

1.3 引物設計

利用在線工具 Primer 3（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），輸入AcerOBP14的核苷酸序列，設計2個相對分子量不同的片段。用于RNAi的對照基因是NCBI 上獲得的綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）（登錄號：JQ064510.1）；用于qRT-PCR的內參基因是NCBI上獲得的AcerArp1（登錄號：HM640276.1）。表1為本試驗所用的引物序列。

表1 本試驗合成的引物Tab.1 Primers synthesized in this study

1.4 體外合成dsRNA

以山西農業大學蜜蜂研究團隊保存的含目的基因的質粒（Pet28a/AcerOBP14）為模板進行PCR擴增。擴增之后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后參照瓊脂糖凝膠試劑盒的說明回收純化，并測定回收產物質量以備后續合成dsRNA。按照T7 RiboMAX TM Express RNAi System 說明書合成dsRNA，具體的過程：第1 步在室溫的條件下合成ssRNA；第2步退火合成dsRNA；第3步dsRNA的純化。將dsRNA的濃度測定后于-80 ℃保存待用。

1.5 dsRNA的飼喂

收集中華蜜蜂采集蜂進行dsRNA 的飼喂。RNAi試驗設置：待放置于培養箱中的中蜂饑餓0.5 h后飼喂含有dsAcerOBP14-1的30%糖水的試驗組、含有dsAcerOBP14-2 的30%糖水的試驗組、含有dsGFP的30%糖水的試驗組和只飼喂30%糖水的對照組。經過前期預試驗每只中蜂需飼喂8μg 的dsRNA。一個生物學重復20只中蜂，每組3個生物學重復。置于人工培養箱溫度（28±1）℃、濕度75%±5%培養。

1.6 qRT-PCR測定AcerOBP14的表達量

收集飼喂dsRNA 24、48、72、96 h的蜜蜂各6只液氮速凍，參照Trizol試劑說明書提取RNA，進行質量和濃度測定，以1μg 總RNA 為模板反轉錄合成cDNA。利用qRT-PCR 技術檢測飼喂dsRNA 后蜜蜂體內AcerOBP14的表達情況，選取沉默效率高的AcerOBP14片段和合適的沉默時間。參照2×Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）試劑盒說明操作。反應體系為：2×Realtime PCR Super mix 7.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.6μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 補充至 15 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環。選取中蜂AcerArp1基因為內參基因。每個樣品進行3次技術重復。

1.7 觸角電生理試驗

通過山西農業大學蜜蜂研究團隊前期熒光競爭結合試驗篩選出13 種與AcerOBP14 重組蛋白結合能力較強的氣味物質（表2），將待測的氣味物質溶于石蠟中，終質量濃度為300μg/μL。按照1.5中RNAi干擾效率的分析，選取沉默效率較高的dsRNA片段（dsAcerOBP14-1）及最佳干擾時間（48 h）對目的基因再次進行沉默，然后采中蜂進行觸角電位試驗。用眼科剪將蜜蜂一側觸角自基部剪下后，將觸角固定在涂有導電膠的金屬電極上，保證觸角和導電膠充分接觸。移液槍吸取10μL待測樣品均勻滴加在折疊成“V”形的條狀濾紙（長3 cm，寬1 cm）上，將濾紙塞入巴斯德管，進行EAG測定。本試驗以石蠟為對照，每根觸角為1次重復，至少重復10次。

表2 供試的氣味物質Tab.2 Odorant material used in this study

1.8 數據分析

通過2-ΔΔCt法對熒光定量結果Ct值進行相對表達量分析；單因素方差分析使用SPSS 25.0軟件；作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 體外合成dsRNA結果分析

參照T7 RiboMAX TM Express RNAi System 試劑盒說明書體外合成AcerOBP14-1和AcerOBP14-2的dsRNA。測定濃度和質量之后，取1 μL dsRNA經20 倍稀釋后電泳檢測。AcerOBP14-1 的片段長度為 168 bp，AcerOBP14-2 的片段長度為 189 bp。從圖1 可以看出，dsRNA 片段條帶清晰，大小均與預期相一致，經核酸定量儀測定后的dsRNA用于后續基因沉默介導試驗。

2.2 qRT-PCR檢測結果分析

qRT-PCR 檢 測AcerOBP14-1 和AcerOBP14-2在不同時間處理組中mRNA 的表達差異，確定最佳的干擾條件。從圖2 可以看出，AcerOBP14-1 和AcerOBP14-2 的dsRNA 片段均能夠在不同程度上降低mRNA 的表達水平。dsAcerOBP14-1 和dsAcerOBP14-2 在飼喂24、48、72、96 h 后dsRNA 的表達量均極顯著低于糖水組和dsGFP組（P＜0.05），dsAcerOBP14-1 在飼喂 48 h 時沉默效果最好，沉默效率達68.9%。

2.3 觸角電生理結果分析

根據2.2 中RNAi 介導的基因沉默效率的比較結果，本研究選取干擾效果較好的dsAcerOBP14-1再次飼喂采集蜂，并于飼喂48 h 后進行EAG 試驗如圖3所示。

由圖3可知，飼喂dsRNA后的中華蜜蜂觸角對2-庚酮、α-法尼烯、β-羅勒烯和檸檬醛的EAG相對值極顯著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG相對值顯著降低（P＜0.05），說明這幾種氣味物質是AcerOBP14結合特異性較高的配體物質。

3 結論與討論

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是在動植物中廣泛存在的一種序列特異性的基因表達抑制，它通過降解mRNA、抑制翻譯和重構染色質來調節基因表達，是一種廣泛且高效的研究昆蟲發育、生殖、行為和免疫相關基因功能的試驗方法[20]。目前，已在鞘翅目[21]、半翅目[22]、鱗翅目[23]、蜱螨目[24]等生物體上都得到了廣泛應用。RNAi 主要有注射法、浸泡法、飼喂法、轉基因、病毒感染等方式，由于飼喂法操作簡單，對受試昆蟲機械損傷小等原因，是較常用的一種RNAi方式。陳藝杰[25]通過飼喂法沉默意大利蜜蜂AmTO1基因，結果發現，干擾組（AmTO1）目的基因的表達量顯著低于對照組；范文艷[26]通過飼喂法探究AccT5H-1基因沉默后中華蜜蜂體內抗氧化基因的表達量，結果顯示，沉默后中華蜜蜂體內其他抗性基因的表達量均上調。晁玉珍[27]通過飼喂法沉默中華蜜蜂體內AccMKP3和AccApoD基因，發現有抗氧化基因的轉錄水平變化明顯，并且POD、SOD 和CAT 這些抗氧化酶的活性也明顯增加。從這些研究結果可見，通過飼喂法沉默蜜蜂體內基因的表達可以產生良好的效果。本試驗通過飼喂法干擾中蜂采集蜂AcerOBP14的基因表達量，通過qRT-PCR 檢測在不同時間處理組中mRNA的表達差異，最終篩選出了最佳的干擾片段及確定了最佳的干擾條件，即dsAcerOBP14-1 較dsAcerOBP14-2 沉默效果更好，且在飼喂48 h 時沉默效果最好，沉默效率達68.9%。WICHER 等[28]在對果蠅（Drosophila melanogaster）胚胎進行RNA 干擾時發現，隨著dsRNA 鏈的增長RNAi 干擾效果增強，片段長的dsRNA干擾活性較大。郭麗娜等[29]研究了中華蜜蜂氣味受體AcerOr2，設計并合成了3個不同大小的dsRNA 片段進行RNAi，發現短鏈dsRNA 沉默效果最好。而本試驗中AcerOBP14同樣是片段短的dsRNA沉默效果較好，這可能是因為同源性很高的基因，長鏈dsRNA造成了非靶標基因沉默，故短鏈dsRNA的干擾效果更好。

觸角電生理（EAG）可以靈敏記錄昆蟲觸角對微量信息物的反應，通過測試刺激引起的受體電位反應值的大小可以判斷刺激物對昆蟲是否有活性，或者昆蟲是否對刺激物產生反應，它代表了觸角對所測試化合物的嗅覺靈敏度，是昆蟲嗅覺、信息素生物測定研究的重要技術之一[30]。徐偉等[31]通過EAG 檢測發現，β-石竹烯和芳樟醇對中華弧麗金龜甲（Popillia quadriguttata）的雌蟲有明顯的引誘作用；蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲觸角對（-）-α-蒎烯、壬醛、（+）-α-蒎烯、苯甲醛、癸醛、丙烯酸丁酯產生較強觸角電位反應[32]。

本研究結合前期熒光競爭結合試驗的結果，選擇干擾效果較好的dsRNA 片段再次飼喂中蜂采集蜂進行EAG試驗。結果發現，中蜂觸角對2-庚酮、α-法尼烯、β-羅勒烯和檸檬醛的EAG 反應值極顯著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG 反應值顯著降低（P＜0.05），法尼醇、油酸甲酯、β-石竹烯、亞麻酸、（+）-3-蒈烯、1-辛醇和丁香酚的EAG反應值變化不顯著。研究表明，2-庚酮是一種報警信息素，當工蜂成為守衛蜂或采集蜂時，它們的上顎腺就能產生類似干乳酪氣味的化合物2-庚酮。蜂群發生盜蜂或有其他蜂王入侵時，守衛蜂或采集蜂就會產生2-庚酮這種危險的信號，接受到信號的本群工蜂也分泌這種信息素，召集富于攻擊性的工蜂以驅趕入侵者保護蜂巢[33]。橙花醇和檸檬醛屬于那氏信息素，它是由工蜂那氏腺分泌的、具有特殊氣味的信息化學物質，在蜜蜂的許多活動中起引導和定向作用有利于工蜂確定巢位[34]。NICHOLAS等[35]研究發現，橙花醇對工蜂具有高度吸引力。另外，那氏腺分泌物可以調節分蜂及蜂群移動，還能夠吸引散團的工蜂重新集結[36]。因此，推測AcerOBP14可能參與蜂群的有序進行，對蜂群的穩定起到重要作用。有研究發現了另一種蜜蜂幼蟲信息素β-羅勒烯，它有抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟，提高工蜂采粉行為及增加哺育蜂訪問巢房頻率的作用[37]。吳帆[38]通過EAG試驗發現，漿蜂和意蜂哺育蜂觸角可以在3 ms 內識別幼蟲揮發物β-羅勒烯，漿蜂哺育蜂對低濃度的β-羅勒烯有很強的反應，說明漿蜂哺育蜂對幼蟲揮發性信息素β-羅勒烯識別很靈敏。這對于工蜂飼喂幼蟲發揮著關鍵性作用，工蜂可以根據β-羅勒烯這種信號調節幼蟲食物分配。另外，β-羅勒烯還是蘭科石斛花的重要成分，胡椒酮和α-法尼烯也屬于植物花香揮發物，它們的花香在蜂蝶類授粉中發揮著重要作用。由此推測，AcerOBP14可能參與工蜂的采集、幼蟲食物分配等相關行為。然而，對于蜜蜂這種具有高度社會性特征的群體，參與其生命活動的一些行為不單單由一個基因調控，需要多個基因協同作用，因此，了解OBPs在蜜蜂行為活動中承擔的角色，對探究蜜蜂嗅覺分子機制具有重要的作用。

綜上所述，中華蜜蜂氣味結合蛋白AcerOBP14-1和AcerOBP14-2 的dsRNA 片段均能在不同程度上降低目的基因mRNA表達水平。dsAcerOBP14-1有較好的沉默效果，且在飼喂48 h 時沉默效果最好。EAG 試驗表明，中蜂觸角對2-庚酮、α-法尼烯、β-羅勒烯和檸檬醛的EAG反應值在飼喂dsRNA前后極顯著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG 反應值顯著降低（P＜0.05）。推測AcerOBP14可能參與了工蜂采集、幼蟲食物分配及蜂群秩序維護等相關行為。