替莫唑胺四價鉑配合物的合成及抗腫瘤性能

蘇 巖 王萌萌 劉紅科 蘇 志

(南京師范大學化學與材料科學學院，南京 210023)

0 引言

膠質瘤亦稱神經膠質瘤，是源于神經膠質細胞的腫瘤，約占所有顱內腫瘤的60%，具有發病率高、復發率高、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點，是全身腫瘤中治療難度最大和預后最差的腫瘤之一[1-6]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是目前臨床一線唯一的神經膠質瘤化療藥物，但存在著骨髓抑制、遺傳毒性和生殖毒性等副作用，影響其長期使用[7-8]。TMZ本身沒有活性，是一種前體藥物，需要在生理pH條件下，經過非酶催化途徑先轉化為活性化合物 5-(3-甲基三嗪-1-基)咪唑-4-酰胺(MTIC)，隨后進一步水解為活性代謝物5-氨基-咪唑-4-酰胺(AIC)和重氮甲烷[9]。重氮甲烷被認為是烷基化的活性片段，通過對DNA甲基化導致DNA復制的停滯，達到抗腫瘤作用[9]。相關研究也表明TMZ治療過程中存在耐藥性問題，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)高表達增加腫瘤細胞對烷化劑類的耐藥性，MGMT是一種DNA修復蛋白，能夠移除DNA上鳥嘌呤O6位點的細胞毒性的烷基加合物，保護細胞對抗TMZ等烷化劑的損害，減弱TMZ的抗腫瘤效應[10-11]。盡管將TMZ添加到膠質瘤治療方案中有效將膠質瘤患者中位總生存期延長到15個月，但患者的愈后5年總生存率仍低于10%[12-13]。因此研制新的抗膠質瘤藥物迫在眉睫。

近年來以順鉑(cisplatin)為代表的鉑類抗腫瘤藥物已經成為無機藥物領域中最為成功的金屬藥物之一[14-16]。順鉑主要是以細胞核內的DNA為作用靶標，Pt原子與DNA上的鳥嘌呤等堿基的N7原子進行配位，形成DNA鏈內或者鏈間交聯產物，通過改變DNA的構象來抑制DNA的復制和轉錄等活動，最終引發細胞凋亡而達到抗癌的效果[17-20]。盡管金屬藥物具有巨大的發展潛力且順鉑目前已取得巨大成功，但是他們仍存在一些缺點，包括高發性的耐藥性、較強的腎毒性和神經毒性及對靶標DNA的低選擇性等[21-23]。在鉑類新藥開發的相關研究中，科學家逐漸將目光聚焦到了具有動力學惰性但被還原后又能發揮抗癌活性的Pt（Ⅳ）抗腫瘤化合物上。Pt（Ⅳ）配合物采用八面體構型[24]，通常認為Pt（Ⅳ）配合物的配位取代緩慢，需被細胞內還原性物質還原成Pt（Ⅱ）配合物后才能與DNA反應，不僅可以改善傳統Pt（Ⅱ）藥物口服活性低的缺點，且不易與細胞內的水、氯離子、DNA堿基等親核類物質發生取代反應，改善了傳統Pt（Ⅱ）抗癌藥物毒副作用和耐藥性的缺點[25-26]，因此其作為Pt（Ⅱ）配合物的前藥被廣泛開發。

在本研究中，我們將具有抗膠質瘤活性的TMZ分子引入到順鉑的軸向骨架中，得到2個多功能的Pt（Ⅳ）配合物P1T和P2T。當配合物進入腫瘤細胞后，被細胞內高濃度的含硫分子谷胱甘肽(GSH)等還原為Pt（Ⅱ）化合物和TMZ。Pt（Ⅱ）化合物進入細胞核與DNA結合，從而發揮抗腫瘤活性。TMZ通過對DNA進行甲基化，從而抑制DNA的復制，促進膠質瘤細胞的凋亡，協同增強Pt（Ⅱ）配合物對腫瘤細胞的殺傷作用。通過核磁共振氫譜和碳譜對其進行了基礎表征。利用MTT法評估了配合物對多種腫瘤細胞株的抗增殖活性，并通過流式細胞術、免疫熒光、免疫印跡等實驗探究了配合物誘導腫瘤細胞死亡作用機制，結果表明配合物協同加劇DNA損傷，最終誘導細胞凋亡。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗所用溶劑均采用分析純試劑，根據實驗需要進行純化。除特殊要求，所有反應均在氬氣保護下進行。TMZ及順鉑購自安耐吉試劑公司。二甲基亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等試劑均購于阿拉丁試劑有限公司。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、Dulbecco改良的細胞培養基(DMEM)、鏈霉素和青霉素、胰蛋白消化酶-EDTA、細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒等生物試劑均購于南京凱基生物科技有限公司。

1H NMR和13C NMR使用Bruker Advance Ⅱ400 MHz核磁共振儀檢測。UV-Vis數據采用PerkinElmer Lambda 365紫外可見光譜儀進行收集。細胞毒活性通過多功能酶標儀LabServ K3測定。流式細胞儀型號為BD FACSverse。激光共聚焦顯微鏡為A1 Nikon。采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，X Series 2，Thermo Fisher)測定金屬元素Pt在細胞內的含量。在Mini-Protean Tetra System(BIO RAD)上進行蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗。

1.2 配體及配合物的合成

1.2.1 配體TMZ-COOH

在氬氣保護、冰浴條件下，將TMZ(971 mg，5 mmol)與10 mL濃硫酸H2SO4混合，用恒壓滴液漏斗緩慢滴加NaNO2(1.062 6 g，15.4 mmol)的水溶液(240 mL)，之后在室溫下避光反應17 h。待反應結束后，在冰浴條件下將反應管溫度降至0℃，將反應液轉移至冰水混合物中，低溫攪拌，有大量白色固體析出。過濾并用蒸餾水清洗幾次后，得到較純的產物TMZ-COOH。產率為 67%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 13.36(s，1H)，8.83(s，1H)，3.88(s，3H)。

1.2.2 配體TMZ-ester

稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(210.9 mg，1.10 mmol)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(126.6 mg，1.10 mmol)和TMZ-COOH(195.2 mg，1.0 mmol)置于三頸燒瓶中，氮氣保護下以無水DMF為溶劑(15 mL)在室溫下反應12 h，得到無色溶液。旋轉蒸餾溶液除去DMF，加入冰水后析出固體，過濾并用冰水洗滌2次，真空干燥得到配體TMZ-ester，產率約73.8%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.05(s，1H)，3.94(s，3H)，2.91(d，J=5.6 Hz，4H)。

1.2.3 Oxoplatin的合成

按照文獻方法合成oxoplatin[27-28]。將過氧化氫(30%，20 mL)逐滴滴加到順鉑(400 mg，1.33 mmol)的水溶液(12 mL)中，60℃下回流攪拌4 h。待反應結束后將所得黃色溶液置于室溫下冷卻過夜，得到淺黃色晶體，過濾并用冰水洗滌，真空干燥得到黃色粉末狀產物，產率約67.8%。

1.2.4 配合物P1T的合成

取TMZ-ester(105.2 mg，0.32 mmol)于無水DMSO(5 mL)中攪拌，向該溶液中加入oxoplatin(100 mg，0.30 mmol)的DMSO(5 mL)溶液，在氬氣保護條件下，室溫避光反應72 h。待反應結束后，向溶液中加入乙醚(100 mL)后析出固體，在-20℃下靜置過夜。去除上層清液，將固體依次用乙醚和乙醇洗2遍后，真空干燥得到配合物P1T。產率約60.8%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 8.70(s，1H)，6.22～5.93(m，6H)，3.85(s，3H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ 168.29，139.79，135.20，131.84，128.33，36.47。元素分析按 PtC6H11Cl2N7O4計算的理論值(%)：C，14.09；H，2.15；N，19.17。實驗值(%)：C，14.61；H，2.23；N，19.42。

1.2.5 配合物P2T的合成

在氬氣保護下，將 oxoplatin(100 mg，0.3 mmol)、TMZ-COOH(175.6 mg，0.9 mmol)、三乙胺(TEA)(91 mg，0.9 mmol)和O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)(289 mg，0.9 mmol)溶解于10 mL的無水DMF中，室溫下避光攪拌48 h。反應結束后旋蒸除去溶劑，加入乙醇/水(1∶1，V/V)后析出固體，離心后去除上層溶液，重新溶解于5 mL甲醇，再加入20 mL乙醚后析出固體，如此反復3次后，將析出的固體收集，真空干燥得到配合物P2T。產率約30%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 8.75(s，2H)，6.81(s，6H)，3.87(s，6H)。13C NMR(101 MHz，DMF-d7)：δ 168.29，139.42，135.38，129.68，128.17，35.91。元素分析按PtC12H14Cl2N12O6計算的理論值(%)：C，20.92；H，2.03；N，24.41。實驗值(%)：C，21.02；H，1.84；N，23.88。

1.3 化合物的脂溶性

通過搖瓶法測試化合物的油水分配系數。分別將P1T、P2T、TMZ溶于水相與有機相的混合溶液中，并采用紫外可見光譜進行定量分析。將水和正辛醇飽和2 d后分液，將化合物溶解于水相中，再向溶液中加入等體積正辛醇，置于搖床上勻速振動4 h，將混合相離心10 min(7 000 r·min-1)后分離有機相及水相，用紫外可見光譜分別檢測兩相中的吸光度，通過化合物在有機相和水相中的吸光度的比值求對數計算得出油水分配系數lg Po/w。

1.4 穩定性測試

將配合物P1T與P2T及前體TMZ溶解在含有體積分數1%的DMSO的PBS溶液中，濃度為50μmol·L-1，置于1 cm光路路徑的石英比色皿中，37℃下保持6 h，通過紫外可見光譜測定配合物的吸光度，間隔時間為30 min。將吸光度隨時間變化的圖擬合為適當的等式(A=C0+C1e-kt，其中C0和C1是計算機擬合的常數，A是配合物在時間t時的吸光度)，用于擬合一級反應動力學，以計算半衰期t1/2。

1.5 細胞毒活性測定

原料TMZ、配合物P1T與P2T及其對照藥物順鉑的細胞毒性實驗采用MTT法測定，選擇人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U87MG)、小鼠膠質母細胞瘤細胞(A261)、人非小細胞肺癌細胞(A549)和正常小鼠海馬神經元細胞株(HT-22)進行測試。細胞在含有10%FBS(胎牛血清)、100 μg·mL-1鏈霉素和100 μg·mL-1青霉素(Gibco BRL)的DMEM培養基(Gibco BRL)中培養。在96孔細胞培養板中接種(每孔5 000個)對數生長期的細胞，將細胞在CO2(體積分數5%)、37℃條件下培養過夜以確保細胞貼壁正常生長，加入不同濃度的待測藥物(培養基中含體積分數1%的DMSO溶液)繼續孵育48 h。然后每孔加入20μL的濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續于培養箱中孵育4 h。吸出培養液，在每個孔中加入150μL的DMSO溶液，振蕩2 min后，使用LabServ K3酶標儀讀取570 nm處吸光度值，使用SPSS軟件計算半數抑制濃度IC50值。

1.6 配合物的胞內攝取含量

將A261細胞接種到100 mm培養皿中，培養18 h后，加入含有20 μmol·L-1藥物(順鉑、PIT和P2T)的DMEM培養液繼續培養12 h。結束之后，去除上層培養液，收集細胞并用PBS(4℃)洗滌2次。然后進行消化，每個樣品中依次用濃硝酸(200μL、95℃)消化2 h、過氧化氫(100μL、95℃)消化1 h和濃鹽酸(200μL、95℃)消化2 h。冷卻后用超純水將所得液體稀釋至2 mL，通過ICP-MS測定樣品中金屬Pt的含量，再用各個樣品中的細胞數對細胞內Pt含量進行歸一化。

1.7 細胞周期阻滯檢測

將處于對數生長期的A261細胞以每孔2×104個的初始密度接種到6孔細胞培養板中，培養24 h后，加入不同濃度的待測藥物(含有體積分數1%的DMSO的DMEM培養基溶液)。繼續孵育24 h后，消化并收集細胞。用PBS洗滌2次后加入300μL PBS重懸細胞，然后向其中緩慢滴加700μL冰乙醇，過夜以固定細胞。固定結束后，5 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2次，加入提前配好的碘化丙啶染色液(PI/RNase A，9∶1，V/V)，室溫下避光靜置30 min，隨后立即使用BD FACSverse流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，發射波長為620 nm，使用FlowJo 7.6軟件處理數據。

1.8 細胞內活性氧檢測

將處于對數生長期的A261細胞以每孔2×104個的初始密度接種到6孔細胞培養板中，培養24 h后，加入不同濃度的待測配合物(含有體積分數1%的DMSO的DMEM培養基溶液)。繼續孵育24 h后，收集細胞，用DMEM培養基洗滌2次，并向其中加入10 μmol·L-1活性氧探針DCFH-DA(2′，7′-dichlorofluorescein diacetate)，避光繼續孵育30 min。PBS洗滌2次后收集細胞并用PBS重懸細胞。隨后立即使用BD FACSverse流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，發射波長為510～540 nm，使用FlowJo 7.6軟件處理數據。

1.9 細胞凋亡檢測

將處于對數生長期的A261細胞以每孔2×104個的初始密度接種到6孔細胞培養板中，培養24 h后，加入不同濃度的待測配合物(含有體積分數1%的DMSO的DMEM培養基溶液)。繼續孵育48 h后，收集細胞，用PBS洗滌2次后用500μL的Binding buffer重懸細胞。隨后加入5μL的Annexin V-FITC混勻，避光孵育15 min后，加入5μL的PI，避光繼續孵育15 min，使用BD FACSverse流式細胞儀對樣品進行檢測。FITC的激發波長為488 nm，發射波長為500～560 nm。PI的激發波長為488 nm，發射波長為620 nm。使用FlowJo 7.6軟件處理數據。

1.10 免疫熒光

在共聚焦小皿中種入A261細胞，培養箱中孵化24 h后去除培養液，代之以含有不同濃度的待測藥物的DMEM培養基溶液(含有體積分數1%的DMSO)。用培養液繼續培養48 h。去除上層清液，用PBS洗2遍后立即用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，以0.3%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。PBS洗3遍后吸干PBS，加入5%的牛血清蛋白(BSA)溶液(其中含有 0.3%Triton X-100)，室溫封閉30 min。吸干封閉液，加入一抗稀釋液，4℃過夜。去除一抗稀釋液，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3遍，加入稀釋好的FITC熒光二抗，37℃避光孵育1 h，PBST洗3遍。滴加Hoechst 33342稀釋液避光孵育5 min，PBST洗去殘留液體，用共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.11 免疫印跡

細胞中全蛋白通過RIPA裂解液提取，于冰上裂解30 min后，高速離心(12 000 r·min-1，20 min)，取上層清液通過BCA法測定蛋白濃度。通過加水和5×Loading buffer把各個樣品的蛋白濃度稀釋成4μg·μL-1，95 ℃孵育10 min，獲得蛋白樣品。在電泳緩沖液中進行電泳實驗，每孔中加入20μL各蛋白樣品。電泳結束后，把蛋白轉于聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，將載有蛋白的PVDF膜置于含5%脫脂牛奶的1×TBST溶液中封閉1 h。然后用對應一抗稀釋液孵育目標條帶的PVDF膜，在4℃下過夜。第二天，用1×TBST緩沖液洗3次。繼續在室溫下用相應的二抗進行孵育1 h，1×TBST洗3次后，化學發光儀曝光成像。

2 結果與討論

2.1 配體及配合物的合成及結構表征

將前體TMZ依據文獻報道方法進行化學修飾得到TMZ-COOH(3-methyl-4-oxo-3，4-dihydroimidazo[5,1-d][1,2,3,5]tetrazine-8-carboxylic acid)和TMZ-ester(2，5-dioxopyrrolidin-1-yl-3-methyl-4-oxo-3，4-dihydroimidazo[5，1-d][1，2，3，5]tetrazine-8-carboxylate)[29]。Pt（Ⅱ）前體用過氧化氫氧化，隨后在Pt（Ⅳ）中心的軸向位置引入TMZ-ester或TMZ-COOH配體得到最終產物P1T或P2T。合成路徑如圖1、2所示。通過1H NMR和13C NMR對配體TMZ-COOH、TMZ-ester及配合物P1T和P2T進行了表征(圖3)。

圖1 配合物P1T的合成路線Fig.1 Synthetic route of complex P1T

圖2 配合物P2T的合成路線Fig.2 Synthetic route of complex P2T

圖3 配合物P1T和P2T的核磁譜圖Fig.3 NMR spectra of P1T and P2T

2.2 配合物的油水分配系數

化合物的親脂性是衡量細胞攝取量的重要指標[30]。研究表明，化合物的親脂性影響藥物穿過細胞膜的能力，進而影響藥物在細胞內的累積以及藥效[31]。因此，評價藥物的親脂性是研究藥物藥理活性的基礎。我們采用搖瓶法測定了配合物P1T和P2T、配體TMZ的脂溶性，即藥物在正辛醇和水中的油水分配系數(lg Po/w)，結果分別為-1.26±0.12、-1.30±0.08、-1.02±0.07，而順鉑的數值為-2.30[32]，因此，通過對順鉑氧化修飾TMZ能夠顯著提高其脂溶性，進而可能提高其細胞攝取能力。

2.3 配合物的水解穩定性

在生理條件下，TMZ可以很快轉化為MITC，而MITC隨后水解為甲基重氮鹽，重氮甲烷被認為具有抗腫瘤作用[9]。因此我們利用紫外可見光譜研究配合物P1T和P2T及配體TMZ在PBS(含有1%DMSO)中的水解速率。如圖4所示，TMZ的特征吸收峰為255和330 nm，配合物P1T和P2T也表現出類似的特征吸收峰。在240 min內，TMZ在255和330 nm處的吸收峰發生明顯改變，在255 nm處的吸收峰減弱，在330 nm處的吸收峰增加，表明TMZ發生了水解。配合物P1T和P2T也表現出類似的現象，表明2個配合物也發生了水解。利用一級反應動力學方程計算出TMZ水解的t1/2為139 min，配合物P1T和P2T水解的t1/2分別為167和123 min，表明配合物進入細胞后能夠在較快時間內水解，以發揮抗腫瘤作用。

圖4 P1T、P2T和配體TMZ在含1% DMSO的PBS中的穩定性Fig.4 Stability of P1T,P2T,and ligand TMZ in PBS containing 1% DMSO

2.4 細胞毒性研究

通過MTT法研究了TMZ以及配合物P1T和P2T對U87MG、A261、A549和HT-22的48 h體外細胞毒性，并以順鉑作為陽性對照藥物。從表1可以看出，配體TMZ對膠質瘤細胞株和正常細胞毒性較小(IC50＞1 000 μmol·L-1)，遠低于順鉑的毒性。與TMZ相比，配合物P1T和P2T對膠質瘤細胞株表現出與順鉑相當的細胞毒活性，其對A261細胞的IC50值分別為21.08和23.96 μmol·L-1，同時對正常神經細胞毒性較小，對HT-22細胞的IC50值分別為85.19和55.86μmol·L-1，表明引入TMZ的四價鉑配合物不僅對腫瘤細胞具有較好的細胞毒性，而且對正常細胞具有較低的毒副作用。為了探究配合物P1T和P2T對多種細胞株的作用機理，我們選用配合物細胞毒性最優的A261細胞深入研究配合物對細胞周期的影響、誘導細胞死亡的方式以及相關分子機制。

表1 P1T、P2T、TMZ及順鉑對不同類型細胞株作用48 h后的IC50值Table 1 IC50values towards different cell lines treated with P1T,P2T,TMZ and cisplatin for 48 hμmol·L-1

2.5 細胞攝取

為了進一步探索配合物P1T和P2T進入細胞的能力，我們利用ICP-MS檢測分析了經藥物刺激后A261細胞內的金屬Pt含量。如圖5所示，P1T、P2T和順鉑刺激后106個A261細胞內的Pt含量分別為42.79、44.61和84.10 ng。攝取數據的結果與上述檢測的配合物的脂溶性的結果似乎不一致，說明藥物的親脂性并不是細胞攝取的唯一決定因素，其他因素如分子大小和電性結構等也會對細胞攝取產生影響。由于順鉑進入細胞內Pt攝取量最高，順鉑的細胞毒活性相比于P1T和P2T更優，但對正常細胞也表現出極高的細胞毒性，而P1T和P2T表現出較好的細胞選擇性。

圖5 ICP-MS檢測的P1T、P2T和順鉑在106個A261細胞內的鉑含量Fig.5 Intracellular Pt content of P1T,P2T and cisplatin in 106A261 cells by ICP-MS

2.6 DNA損傷分析

γH2AX是組蛋白H2AX的一種磷酸化蛋白，它是DNA雙鏈斷裂的標志蛋白[33]。文獻報道順鉑能夠誘導細胞中DNA損傷，進而活化γH2AX，所以γH2AX是研究鉑類藥物誘導細胞內DNA損傷的重要標志物[34]。我們采用免疫印跡的方法研究了藥物刺激后細胞中γH2AX的表達，結果如圖6a所示。配合物P1T和P2T顯著引起了細胞中γH2AX的表達，說明DNA損傷正在發生。同時我們也測試了DNA損傷下游蛋白p53的表達，它的表達也是DNA損傷通路中的一個重要事件，p53的活化能夠啟動細胞發生凋亡[35]。配合物P1T和P2T處理過的細胞中p53也顯著激活，這意味著損傷的DNA沒有被修復，p53開始引發細胞凋亡程序。我們利用免疫熒光進一步驗證藥物作用后細胞內γH2AX蛋白的表達變化。如圖6b所示，經配合物P1T和P2T作用后細胞核中γH2AX熒光信號明顯增強，表明配合物誘導DNA損傷。

圖6 (a)蛋白印跡顯示經不同藥物作用后A261細胞內γH2AX、p53蛋白的表達;(b)共聚焦顯微鏡顯示經不同藥物作用后γH2AX在A261細胞內的表達Fig.6 (a)Western blot showing the expression of γH2AX,p53 protein in A261 cells after treatment with different drugs;(b)Confocal microscope images of expression of γH2AX in A261 cells after treatment with different drugs

2.7 細胞周期檢測

細胞周期是指連續分裂的細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的全過程，一個細胞周期包括分裂間期與分裂期2個階段，其中分裂間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)以及DNA合成后期(G2/M期)。細胞內DNA損傷會引起細胞周期的阻滯[36]。我們用核酸染料PI標記DNA，通過流式細胞術研究藥物對細胞周期的影響，實驗結果如圖7所示，P1T和P2T以及順鉑均具有阻滯細胞周期的能力。P1T和P2T主要阻滯了細胞的G2/M期，而順鉑主要阻滯細胞的S期。推測配合物P1T和P2T主要通過干擾DNA合成復制，抑制腫瘤細胞增殖，進一步誘導細胞死亡。

圖7 不同藥物對A261細胞周期阻滯的影響：(a)control、(b)P1T、(c)P2T和(d)cisplatin的細胞周期分布;(e)細胞周期分布柱狀圖Fig.7 Effect of different drugs on A261 cell cycle arrest：cell cycle distributions of(a)control,(b)P1T,(c)P2T and(d)cisplatin;(e)histogram of cell cycle distributions

2.8 細胞內活性氧檢測

正常細胞通過控制細胞內活性氧(ROS)水平來調控細胞內信號傳導、細胞增殖及細胞死亡等生理過程[37-38]。因此，為了進一步研究配合物P1T和P2T誘導細胞死亡的作用機理，我們選擇商用ROS熒光探針DCFH-DA檢測了腫瘤細胞中ROS水平。細胞中產生的ROS可以將無熒光的DCFH-DA氧化為有熒光的DCF(dichlorofluorescein)，因此可通過DCF的熒光強度來指示細胞內ROS的水平[39]。我們先將配合物與A261細胞共孵育24 h，然后加入ROS熒光探針繼續孵育30 min，利用流式細胞儀檢測了細胞內ROS水平的變化。如圖8所示，與順鉑或對照組相比，配合物刺激后A261細胞中相對熒光強度無明顯變化，這表明引入TMZ配體的配合物P1T和P2T無法誘導細胞產生過量的ROS，推測配合物主要是以其他方式誘導細胞死亡。

圖8 不同藥物作用后A261細胞內的ROS水平Fig.8 ROS levels in A261 cell after treatment with different drugs

2.9 細胞凋亡檢測

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，普遍存在于生物界。對正常細胞而言，細胞膜內側分布有大量磷脂酰絲氨酸(PS)，而在細胞發生凋亡早期，PS會外翻到細胞膜表面。Annexin V能與PS特異性地結合，而Annexin V-FITC帶有綠色熒光，因而可用其標識細胞凋亡[40]。核酸染料碘化丙啶(PI)不能透過完整的細胞膜，但是凋亡中晚期的細胞和死細胞的細胞膜通透性增加，PI能夠透過細胞膜對細胞核進行染色，因此PI可以檢測壞死細胞或凋亡晚期的細胞。我們采用流式細胞術研究了分別用P1T、P2T和順鉑刺激A261細胞48 h后的細胞死亡途徑，利用Annexin V-FITC和PI對細胞進行雙染，并用FlowJo軟件對數據進行了分析。如圖9所示，與對照組相比，P1T和P2T以及順鉑均具有誘導A261細胞凋亡的能力。P1T和P2T主要誘導細胞發生晚期凋亡，且表現出劑量依賴性，隨著藥物濃度的增加，晚期凋亡的細胞比例逐漸增加。

圖9 不同藥物作用于A261細胞后導致的細胞凋亡Fig.9 Apoptosis caused by different drugs acting on A261 cell

3 結 論

我們在修飾替莫唑胺的基礎上合成并表征了2種新型四價鉑配合物P1T和P2T，并研究了配合物的抗腫瘤活性及其誘導細胞死亡的作用機制。研究結果表明，與替莫唑胺相比，配合物的細胞毒活性明顯提高，表現出與順鉑相當的細胞毒性，同時表現出較好的細胞選擇性，其對正常細胞的細胞毒性較低。配合物進入細胞后，能在較短時間內發生水解，誘導DNA損傷，阻滯細胞周期在G2/M期，最終誘導細胞凋亡。總之，將替莫唑胺引入到四價鉑配合物中，不僅提高了配合物的細胞毒活性和細胞選擇性，而且拓展了鉑類配合物在腦膠質瘤方面的應用，這些結果將為鉑類金屬抗腫瘤藥物的研發提供一定的指導意義。