石上柏乙酸乙酯萃取物下調LINC02474抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲

高麗麗 陳會娟 王玲

隨著人們生活方式的改變，結直腸癌(CRC)發病率呈迅速上升趨勢，是全球范圍內第四大致命惡性腫瘤[1]。目前，臨床上對于早期CRC患者主要采用手術切除治療，但大部分CRC患者在確診時已處于晚期或發生轉移失去手術機會。化療、放療和靶向治療的應用顯著改善了CRC患者的生存現狀，但仍帶來嚴重的副作用和不良反應。因此，尋找高效、安全、低毒的治療方法是CRC臨床研究的重要課題。石上柏為卷柏科卷柏屬植物深綠卷柏的全草，具有清熱解毒、抗癌、止血等功效，現廣泛應用于肝炎、肺炎和風濕病等的治療[2]。多項研究證實，石上柏對喉癌、鼻咽癌、肝癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤具有顯著的抗腫瘤作用，但其對結直腸癌的防治作用鮮有報道[3-6]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度200個核苷酸的非編碼RNA，其通過在轉錄、轉錄后、染色質修飾和基因組印記水平調節基因表達，參與細胞周期、細胞分化、轉移等多種生物學過程，是腫瘤治療的重要靶標[7]。長基因間非編碼RNA 02474(LINC02474)位于染色體1q41，現有研究顯示結直腸癌組織LINC02474表達上調，LINC02474高表達與結直腸癌發生、發展和預后密切相關[8,9]。本研究從細胞增殖、周期分布、遷移和侵襲角度研究了石上柏在CRC中的抗腫瘤作用，并檢測LINC02474表達變化，以期為開發石上柏用于防治CRC奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞Caco-2、DMEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購自武漢普諾賽生命科技公司；空載體質粒(pcDNA)、LINC02474過表達質粒(pcDNA-LINC02474)購自上海生工生物公司；細胞周期檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；Transwell小室和基質膠購于美國Millipore公司；PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II購于大連寶生物科技公司；兔源上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)多克隆抗體、兔源神經鈣黏素(N-cadherin)多克隆抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購于上海碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 石上柏乙酸乙酯萃取物制備:參考黃茹意等[3]方法制備石上柏乙酸乙酯萃取物。取500 g干燥石上柏，粉碎后等量分裝于兩個圓底燒瓶中，按照料液比1∶8加入70%乙醇，85℃回流提取2 h，回流提取3次后，合并提取液，過濾，經旋轉蒸發器濃縮得乙醇浸膏。用200 ml水復溶乙醇浸膏，用等體積乙酸乙酯萃取3次，濃縮干燥萃取液即為石上柏乙酸乙酯萃取物。用1 ml二甲亞砜溶解100 mg石上柏乙酸乙酯萃取物，4℃保存備用。

1.2.2 細胞培養和實驗分組:Caco-2細胞采用含20%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基于CO2體積分數為5%的37℃細胞培養箱中培養。細胞80%匯合時，按照1:4比例轉移至新的培養皿，每隔1 d 換液1次，取對數期細胞用于后續實驗。將Caco-2細胞接種96孔板，細胞貼壁后用石上柏乙酸乙酯萃取物終濃度分別為0、7.5、15.0、30.0 μg/ml的DMEM培養基孵育細胞48 h，依次記為對照組、石上柏-低、石上柏-中、石上柏-高組。為證石上柏的抗腫瘤作用與調控LINC02474表達有關，利用Lipofectamine 2000將pcDNA、pcDNA-LINC02474分別轉染融合度為50%的Caco-2細胞，48 h后用含30.0 μg/ml石上柏乙酸乙酯萃取物的DMEM培養基孵育細胞48 h，依次記為石上柏-高+pcDNA組、石上柏-高+pcDNA-LINC02474。

1.2.3 集落形成實驗檢測細胞克隆能力:每組取2 ml單細胞懸液(細胞數約為3×102)接種到6孔板中，輕輕振動培養板，使細胞均勻擴散，并置于常規細胞培養箱中培養細胞14～21 d。當觀察到可見細胞時終止培養。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，10%甲醇和10%乙酸固定細胞，0.4%的結晶紫染色。顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.2.4 流式細胞術檢測周期分布:用胰酶消化各組細胞，1 200 r/min離心5 min棄去培養基。PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min后收集細胞。用預冷的70%乙醇4℃固定細胞12 h，PBS洗滌細胞2次，加入RnaseA室溫避光孵育細胞30 min。加入碘化丙啶染色1 h后，流式細胞儀分析細胞周期分布。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲:每組取200 μl細胞懸液(細胞約為1×104，不含胎牛血清)接種涂有基質膠的Transwell小室中；將含有20%胎牛血清的培養基加入到24孔板下室作為誘導劑。將Transwell裝置至于培養箱中孵育24 h后，去除Transwell膜上表面的基質膠和細胞，甲醇固定Transwell膜下表面30 min，結晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下計數，以5個視野的均值表示侵襲細胞數。

1.2.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移:每組取1×106個細胞接種6孔板，當細胞80%融合時用移液槍頭尖端劃線，記為劃痕0 h，在劃痕0 h、48 h時分別測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度48 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.2.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC02474表達:按照Trizol使用說明書提取總RNA，利用PrimeScript逆轉錄試劑盒將500ng RNA轉錄成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq II說明進行RT-qPCR反應。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算LINC02474相對表達量。引物序列如下：LINC02474上游5’-CAGCATCTGCCTTT GACCACA-3’，下游5’-CCCATTTCAGGGTAGGGAAAAT-3’；GAPDH上游5’-CTGGGCTAC ACTGAGCACC-3’，下游5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。

1.2.8 蛋白質印記(Western blot)檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達:放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解各組細胞，BCA試劑盒進行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離適量蛋白樣品，并轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂奶封閉膜2 h，加入兔源E-cadherin抗體(1∶1 000)、兔源N-cadherin抗體(1∶500)4℃下孵育12 h。用二抗(1∶1 000)室溫下孵育膜2 h。加入增強型化學發光顯色試劑顯影，Image J軟件分析E-cadherin、N-cadherin相對表達量。

2 結果

2.1 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2增殖的影響 與對照組比較，石上柏-低、中、高組Caco-2細胞克隆形成數、S期細胞比例顯著降低，G0-G1期細胞比例顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且石上柏-低、中、高組間克隆形成數、S期和G0～G1期細胞比例比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2增殖的影響

2.2 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2遷移侵襲的影響 與對照組比較，石上柏-低、中、高組Caco-2細胞侵襲數、劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。且石上柏-低、中、高組間比較，侵襲細胞數、劃痕愈合率、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2遷移侵襲的影響

圖1 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

2.3 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2中LINC02474表達的影響 與對照組比較，石上柏-低、中、高組Caco-2細胞LINC02474表達顯著降低(P<0.05)，且石上柏-低、中、高組間LINC02474表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2中LINC02474表達的影響

2.4 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2的增殖抑制作用 與石上柏-高+pcDNA組比較，石上柏-高+pcDNA-LINC02474組Caco-2細胞克隆形成數、S期細胞比例顯著升高，G0-G1期細胞比例顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2的增殖抑制作用

2.5 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2遷移和侵襲的抑制作用 與石上柏-高+pcDNA組比較，石上柏-高+pcDNA-LINC02474組Caco-2細胞侵襲數、劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對Caco-2的遷移、侵襲抑制作用

圖2 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

3 討論

石上柏參與調節細胞增殖、凋亡、周期分布、遷移侵襲等多個生物學過程[2]。李三華等[10]發現石上柏乙酸乙酯提取物對肺癌細胞A-549和肝癌細胞SMMC-7721具有顯著的抑制作用，當藥物濃度為200 μg/ml作用48 h時，對細胞抑制率可高達90%。黃茹意等[3]的研究發現，石上柏乙酸乙酯提取物可抑制喉癌Hep-2細胞的生長和遷移，誘導G1期周期阻滯。此外，石上柏石油醚和乙酸乙酯提取物還可有效降低卵巢癌細胞OVCAR-3的侵襲能力[6]。本研究采用低、中、高劑量濃度探討石上柏在CRC中的抗腫瘤作用，結果顯示，石上柏乙酸乙酯提取物作用后Caco-2細胞的克隆形成能力、S期細胞比例可顯著降低，G0-G1期細胞比例顯著升高，并呈劑量依賴效應。

腫瘤的侵襲和轉移是一個多因素、多階段的過程，與癌細胞和與之生長的內部環境有關。E-cadherin是維持典型上皮細胞胞間連接結構的Ca2+依賴性粘附分子，E-cadherin表達缺失、間充質細胞標志物N-cadherin表達增加導致細胞骨架重塑和形態發生改變，促進癌細胞的侵襲轉移[11,12]。E-cadherin低表達和N-cadherin高表達與CRC局部浸潤深度、腫瘤分期、腫瘤分化程度和和較差的生存率密切相關[13,14]。本研究發現，石上柏乙酸乙酯提取物呈劑量依賴效應降低侵襲細胞數和劃痕愈合率，降低E-cadherin蛋白表達，提高N-cadherin蛋白表達水平。以上研究結果提示，石上柏乙酸乙酯提取物可降低CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

近年來，多項研究證實lncRNA廣泛參與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的調控[15-17]。Wang等[15]研究證實lncRNA小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)通過靶向上游移碼突變體(UPF1)激活轉化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路促進CRC細胞的增殖、轉移和體內腫瘤生長。Zhang等[16]發現lncRNA CPS1內含子轉錄本1(CPS1-IT1)顯著降低CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并加速細胞凋亡。此外，銀杏葉提取物通過上調lincRNA-p21表達還可抑制結直腸癌細胞的遷移[17]。最近發現LINC02474在結腸癌中表達上調，LINC02474表達水平對結腸癌患者預后具有預測價值[9]。

本研究中石上柏乙酸乙酯提取物處理后Caco-2細胞中LINC02474表達呈劑量依賴性降低，提示石上柏乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用可能與調控LINC02474表達有關。通過轉染pcDNA-LINC02474發現上調LINC02474表達可降低石上柏乙酸乙酯提取物對Caco-2細胞克隆形成、周期分布、遷移和侵襲的影響，恢復細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這進一步表明石上柏乙酸乙酯提取物在CRC中抗腫瘤作用可能與下調LINC02474表達有關。

綜上所述，石上柏乙酸乙酯提取物可能通過下調LINC02474抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，這可能是石上柏在CRC中發揮抗腫瘤作用的重要機制，為石上柏開發成CRC臨床治療的藥物提供了理論依據。