DHPLC聯合一代測序技術在脊髓肌萎縮癥攜帶者篩查中的應用

劉春苗 孟雁欣 張志敏 楊揚 王亞男 張海娟

脊髓肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)因脊髓前角α-運動神經元退化變性引起的一組以緩慢進行性加重肌無力、肌萎縮為主要臨床特征的常染色體隱性遺傳性骨骼肌疾病，繼杜興型肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)之后第二常見嬰幼兒致死性骨骼肌遺傳病[1,2]。研究指出 95% 因 SMN1 純合缺失(“0+0”型)致病，5% 因SMN1復合雜合突變(“0+1”型)致病[3]。部分研究證實白種人群中存在雙等位基因均為微小變異致病[4]。因此，SMN1雙等位基因致病性變異作為SMA發病機制，也是診斷SMA金標準。SMN2與SMN1序列具有高度同源性且均分布在5q13.2，作為公認的SMA修飾因子，研究指出患者攜帶 SMN2 拷貝數越多表型越輕，盡管其與表型的相關性不完全一致，但國內外SMA管理共識中仍將SMN2 拷貝數作為 SMA 診斷的標準步驟之一[5]。全美醫學遺傳學會(american college of medical genetics,ACMG)早在2008年即推薦將SMA攜帶者/產前篩查納入常規孕前檢查項目，并建議對高風險夫婦妊娠胎兒進行產前診斷或植入前診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)[6]。本研究基于SMA分子致病特征，將高效液相色譜技術(DHPLC)作為SMN1/SMN2拷貝檢測手段，同時聯合一代測序技術對患者序慣性進行點突變檢測，以證實DHPLC聯合一代測序技術在脊髓肌萎縮癥攜帶者/產前篩查中有重要臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2019年1月因孕前篩查于石家莊市第四醫院產前診斷中心就診患者3 544例，其中男1 399例，女2 145例。簽署知情同意書，抽取外周血3 ml。

1.2 分子生物學分析

1.2.1 DNA提取、PCR擴增：抽取3 ml外周血，天根DNA提取試劑盒獲得基因組DNA，NanoDrop1000微量核苷酸蛋白多功能酶標儀(美國Gene公司)定量分析(OD260/OD280比值1.8～2.0)，-80℃保存余DNA樣本。Prime 6 軟件設計引物，覆蓋SMN1/KRIT1/CYBB全長，包括目的基因片段各個外顯子及與內含子交界區，Pubmed blast比對引物。KRIT1/CYBB為內參基因。PCR擴增參數：95℃ 10 min熱啟動預變性，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 s，共25個循環，72℃充分延伸 10 min。2% 瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min。見表1。

表1 PCR擴增片段及引物序列

1.2.2 DHPLC分析：樣本完成PCR擴增進行DHPLC檢測。5 μl PCR 反應樣本上機(美國環球基因公司)，選擇類型DS Multiple Fragment，溫度50℃，上樣、洗脫。應用儀器自帶軟件計算SMN1/KRIT1比值，SMN1/KRIT1等于0純合缺失，雜合缺失或攜帶為0.5，正常人為1。以SMN1/KRIT1 比值作為校正系數，所有比值按照校正系數進行比對后得出數據。

1.2.3 SMN1 測序分析：美國ABI 3730XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)自動測序儀測序。Sequencher v4.90 (Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA) 比對分析，致病變異位點進行家系成員靶向檢測分析。分析變異序列與疾病表型有無共分離現象，進行基因變異位點定位、明確氨基酸變化及功能改變。

2 結果

2.1 3 544 DHPLC結果 3 544例攜帶者檢測樣本中，共檢測出63例攜帶者，包含男33例，女30例，拷貝缺失攜帶者檢出率1.78%。我們進一步對63例SMA攜帶者配偶進行SMN1檢測，測得SMN1變異11例。SMN1缺失變異攜帶者9例(SMN1∶SMN2=1∶1)，SMN1轉換成SMN2 2例(SMN1∶SMN2=1∶3)。見圖1。

圖1 DHPL檢出SMN1缺失攜帶者；A SMN1∶SMN2為1∶1;B SMN1∶SMN2為1∶2; D SMN1∶SMN2=1∶3; SMN1∶SMN2=1∶0

2.2 Sanger測序結果 SMN1 缺失分析檢測后，對3 544 例樣本進行SMN1 靶向測序分析，通過分析明確2例樣本為SMN1點突變變異攜帶者。經Sequence 4.90及NCBI數據庫比對分析證實1例為p.Q164X為致病突變攜帶者，對其配偶分別進行SMN1拷貝缺失及點突變檢測未見異常。余1例為5號內含子位置SNP位點，數據庫比對無顯著致病意義。其他3 542例被檢樣本未檢出致病意義明確變異位點。見表2，圖2、3。

表2 受檢人群、配偶及產前診斷胎兒 SMN1∶SMN2 基因型統計 例

圖2 SMN1 exon4發生:p.Q164X(C>T)變異，編碼氨基酸堿基提前終止

圖3 SMN1 5 號內含子 (第5外顯子下游 59 位：基因組(Hg19)為：chr 5:70,240,639)存在 1 個 SNP(rs754465849)

2.3 產前診斷檢測結果 夫婦雙方知情同意并簽署知情同意書后，我們對11對夫婦雙方均為SMN1攜帶者胎兒于孕18周進行胎兒羊水染色體檢查。測得2例胎兒SMN1純合缺失，即SMA患者，1例胎兒缺失變異攜帶者SMN1∶SMN2=1∶1，1例胎兒為SMN1(p.Q164X)變異點突變攜帶者。余胎兒檢出結果未見異常。后期隨訪過程中，我們分別對11例高危胎兒隨訪，2例SMN1純合缺失胎兒夫婦選擇雙方終止妊娠。余胎兒分娩后未見顯著異常。

2.4 不同SMN1∶SMN2基因變異攜帶者比較 不同SMN1∶SMN2比例攜帶者進行統計學比較，證實SMN1∶SMN2=1∶1最為常見，與其他組別比較具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 不同SMN1∶SMN2基因變異攜帶者檢出率比較 n=78,例(%)

3 討論

3.1 DHPLC應用于SMA攜帶者篩查中的優勢 SMA是嬰幼兒死亡最常見常染色體隱性神經骨骼肌遺傳疾病，臨床多依據臨床表型、心肌酶、肌電圖及骨骼肌活檢進行初步診斷，由于缺乏特異性表型特征而多出現誤診、漏診等情況[7]。與臨床診斷依據比較，SMA基因檢測因特異性強且取材方便的特征，逐漸被廣大臨床醫生及受檢者接受。迄今，已報道的SMA基因檢測方法眾多，如最早的單基因靶向測序技術、多重連接依賴性探針擴增技術(MLPA)、短片段多重定量PCR(QMMPSF)、實時熒光定量PCR(real-time PCR)、聚合酶鏈式限制性長度多態性分析技術(PCR-RFLP)、變性DHPLC等分子檢測技術，此外，近年高分辨溶解曲線技術(HRMA)及液相微珠陣列技術(liquid microbead arrays)等也逐步開始應用于臨床檢測分析[8-10]。已知的上述技術手段不同程度的存在消耗成本高、耗時、點突變變異不靈敏、漏診、誤診率高等問題，因此很難完全在臨床廣泛開展。

DHPLC技術作為高通量、自動化基因突變檢測技術極具代表性，最早多應用于癌癥靶點、藥物研發等領域，與其他測序技術相比較，不需要制備凝膠，且具備全自動、高效、快速、準確、省時省力、成本低等特點。伴隨分子技術向臨床應用的廣泛轉化，DHPLC技術逐漸應用于小片段外顯子缺失檢測。本研究應用DHPLC對3 544例樣本進行SMA攜帶者篩查，共檢出61例缺失變異攜帶者，檢出率約為1.72%。既往研究指出SMA攜帶者基因型變異主要分4種：[0+1]型、[2+0]型、[1+1d]及[2+1d]型，肯定攜帶者人群中以[1+0]型最為常見，即一條染色體SMN1等位基因正常而另一條染色體SMN1缺失的等位基因最為常見[10]。我們檢出的攜帶者中均為[0+1]型，這與既往龔波章等[11]報道一致。

SMN1與SMN2堿基序列同源性高達 99%,由于二者且均分布在5q13.2，因此SMN1與SMN2間基因拷貝數可以相互轉化并參與SMA疾病表型，即SMN2拷貝數增加可以減輕SMA臨床表型[12]。通過檢測SMN1及SMN2 拷貝數可從基因型及臨床表型兩方面綜合評估SMA形成緣由及臨床表型嚴重程度，而SMN1及SMN2 拷貝數變異比值的明確也可為遺傳咨詢提供依據。DHPLC技術除定性分析外，亦能通過確定SMN1與SMN2比值進行定量分析。我們研究中61例拷貝缺失變異攜帶者中，31例SMN1∶SMN2 =1∶1，11例 SMN1∶SMN2 =1∶2。DHPLC還明確檢測出17例攜帶者為SMN1轉換成SMN2(SMN1∶SMN2=1∶3)及2例攜帶者SMN1∶SMN2=1∶0。

基于上述攜帶者檢測基礎，我們同時對61例缺失攜帶者配偶進行SMN變異檢測，測得11例SMN1變異[9例(SMN1∶SMN2=1∶1]；2例(SMN1∶SMN2=1∶3)。以DHPLC對上述夫婦雙方均為攜帶者高危胎兒進行SMN檢測分析，檢測結果證實2例胎兒為SMN1 純合缺失，1例胎兒缺失變異攜帶者SMN1∶SMN2=1∶1。由此不難發現DHPLC對SMA攜帶者篩查或產前診斷均有重要意義，可有效減少相關患兒的出生[13]。

3.2 DHPLC聯合一代測序技術檢測應用于SMA攜帶者篩查的必要性及優勢 SMA 患者95%因SMN1外顯子7/8純合缺失致病，5% SMN1點突變與缺失復合雜合致病[14]，提示點突變檢測對SMN必不可少。盡管DHPLC對拷貝缺失變異檢測極為靈敏，但技術上仍有不足之處，如對PCR要求高，不能直接檢測出純合突變，只能提供個體樣本無突變信息，但無法得出具體突變類型。因此，對點突變變異檢測常會出現漏診或誤診的可能[15]。一代測序技術作為單基因疾病診斷的“金標準”，以單基因單變異作為檢測靶點，檢測靈敏度、特異性毋庸置疑，且同樣具備省時低成本的優勢[16]。本研究技術聯合中依據SMA分子致病特點，選擇一代測序技術作為聯合方法對樣本進行SMN1點突變變異分析。研究檢出1例樣本攜帶SMN1 p.Q164X，1例樣本發生SMN 1 多態性變異位點。因此本研究共計檢出62例SMA攜帶者，DHPLC與一代測序技術的聯合使攜帶者檢出率由1.72%提高至1.75%，一定程度上提高了SMA攜帶者檢出率。我們以同樣的技術聯合方式對夫婦雙方均為攜帶者的高危胎兒進行SMA產前診斷篩查，測得2例胎兒為SMA患者及2例攜帶者[1例胎兒缺失變異攜帶者SMN1∶SMN2=1∶1，1例胎兒為SMN1(p.Q164X)變異點突變攜帶者]。再次提示SMA攜帶者篩查的重要性及技術聯合的必要性。

3.3 河北地區SMN1攜帶者變異特征 研究數據指出SMA人群攜帶率1/100～1/45，亞洲人群攜帶率約1/48，SMA患者同胞攜帶率為66.67%，發病無性別差異[2]。本研究3 544例樣本共計檢測出62例(61例缺失變異帶+1例點突變變異)SMN1變異為致病攜帶者，人群攜帶率約1.75%，與我國宋昉[4]報道北方人群1/60攜帶率一致。但低于既往報道的上海、香港、臺灣等南方地區人群攜帶率，提示SMA除具有較高人群攜帶率外還存在較強的南北地區差異性[17]。我們檢出62例攜帶者中約98.38%為缺失攜帶，男女比例1∶1,證實河北地區SMA攜帶不存在男女性別差異。

綜上所述，SMA分子診斷對于預防及減少此類患兒出生有重要意義，規范、精準SMA攜帶篩查流程建立可有效降低缺陷患兒出生，也是實現SMA二級預防的有效途徑。同時技術聯合可顯著提高SMA攜帶者/患者檢出率，有效減少臨床誤診、漏診。