缺血性腦卒中動物模型的研究進展

董 波,劉嘉欣,熊 偉,唐宋琪,黃 巍

(1.成都中醫藥大學基礎醫學院,成都 611137;2.成都岐黃博恩生物科技有限公司,成都 611130)

缺血性腦卒中（ischemic stroke）指血栓或栓子阻塞腦血管引起短暫或永久腦血流供應障礙，腦組織缺血缺氧壞死，導致神經功能缺損，產生包括偏癱、失語、認知和學習能力受損等一系列臨床綜合征。在所有的卒中病例中，大約87%屬于缺血性腦卒中［1］。治療缺血性腦卒中是目前研究的難點之一。為了更好地理解缺血性腦卒中發生的病理生理學機制，提出合適的治療策略，建立符合條件的動物模型必不可少。然而目前尚沒有一種動物模型可以完全復制人類缺血性腦卒中的特點和發病進程。

缺血性腦卒中模型與實際病例之間存在差異，相似于人類缺血性卒中的動物模型對科研及臨床工作意義重大［2-3］。相關研究［4-6］表明，建立缺血性腦卒中模型可選動物種類包括非人靈長類動物（猴、狒狒等）、嚙齒類動物（小鼠、大鼠、沙鼠等）、非嚙齒類動物（貓、犬、豬、羊等）3大類。根據研究目標挑選最適宜的動物，建立與人類缺血性腦卒中最為相仿的疾病模型對于研究缺血性腦卒中疾病發生機制及防治策略具有關鍵效用。

本文結合文獻，按照動物品種品系、造模時間、造模方法、判定指標對缺血性腦卒中動物模型進行總結，綜合評價各種缺血性腦卒中動物模型的特點，以供研究者根據實驗目的，選擇最恰當的動物模型。

1 缺血性腦卒中動物模型的建立方法

根據缺血性腦卒中的發病部位、病因、診療思路及現在研究者的新發現，對缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法及使用的動物總結如圖1。具體綜述如下。

圖1 缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法Figure 1 Common modeling methods for animal models of ischemic stroke

1.1 局灶性缺血性腦卒中造模方法

1.1.1 線栓法

1986年，日本學者Koizumi等［7］發明了線栓法以制備局灶性腦缺血大鼠模型，基本操作是：于頸總動脈分叉部或頸外動脈殘端插入栓線，栓線相繼經過頸內動脈、大腦后動脈、大腦前動脈起始段；栓線在插入過程中與頸內動脈結合，逐漸閉塞頸內動脈血流，引起大腦中動脈供血區缺血、梗死。1989年，Longa等［8］對此模型進行了改良，其方法為：先分離并結扎頸外動脈，同時暫時性結扎頸總動脈，將頸內動脈進行分離，剪斷頸外動脈，從頸外動脈靠結扎線的遠端做切口，插入尼龍線使其經過頸總動脈分叉進入頸內動脈，至有輕微阻力為止，阻斷鄰近的大腦中動脈所有血供。目前該方法被公認為是局灶性腦缺血模型的標準建立方法，在國內外得到了廣泛運用［9-10］。線栓法造模的優點在于避免了開顱手術，可任意控制再灌注時間，便于實驗研究。

1.1.2 開顱電凝阻斷法

1981年Tamura等［11］提出電凝法，即通過外科手術方法灼燒或結扎腦部血管，造成永久性腦梗死，不發生再灌注。開顱電凝阻斷法的效果穩定，造模成功率高［12］。然而其缺點是由于制作模型過程中需打開硬腦膜，故模型動物大腦可能直接受鉆孔器損傷，或因電凝，腦部血管受熱而受損；且打開硬腦膜后，大腦直接暴露于空氣中，顱內壓會因局部腦區溫度變化受影響［13］。

1.1.3 血栓形成法

通過形成血栓建立腦缺血模型的方法有3種：光化學法、自體血栓法和FeCl3致血栓形成法。

1985年Waston等［14］建立了大鼠光化學法腦缺血模型，其方法為：選定照射部位，充分暴露顱骨，大鼠尾靜脈注射玫瑰紅B，用相應光源進行照射；部位大小可按照需要調整，一般選在皮質功能區如運動感覺區［15-16］，以利于評定觀察。此種模型是光化學法誘導皮質局灶性腦缺血的經典模型，目前已發展為4型［17］。注入動物體內的光敏染料在特定波長光源照射下，發生Ⅱ型光化學反應，產生并釋放單態氧，血管內皮細胞膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，膜通透性增加，血管內皮損害，誘發血小板聚集，光照區血管內血栓形成，使局部腦組織發生不可逆缺血性損傷［18］。在光敏染料注射早期，模型動物即可出現血腦屏障開放、嚴重的血管源性腦水腫及微血管血栓，因此可用于腦梗死后微血管損傷及血腦屏障改變后的病理生理、生化等研究，亦可用于抗血小板藥物防治研究［18-21］。但此方法造成皮質終末動脈永久性閉塞，無法再灌注，不利于側支循環建立及缺血再灌注損傷研究；而且雖有缺血半暗帶存在，但由于范圍狹小且消失快，也不便于觀察缺血半暗帶變化及研究相關藥物的防治作用。

1997年，Busch等［22］用自體血凝塊經頸動脈注射，制成大鼠腦栓塞模型。具體方法是：動物自體血加凝血酶塊制成血栓，導入目標動脈阻斷血流，造成腦組織缺血。該模型可產生顯著而持久的供血中斷，形成范圍衡定和邊界清楚的梗死灶，在確定血栓注射入頸內動脈后，造模成功率達80%以上。本模型具有良好的穩定性和可重復性，更貼近臨床腦栓塞特征，適合于各種腦缺血實驗研究，尤其是溶栓治療的研究。

FeCl3致血栓法制成大腦中動脈栓塞的方法是：暴露大腦中動脈，將吸有50%FeCl3溶液10μL的小片定量濾紙敷在大腦中動脈上，30 min后取下［23］。FeCl3損傷局部大腦中動脈血管內皮，使血管內膜脫落，進而激活血小板，導致局部血栓形成，最終大腦中動脈供血區出現梗塞。此模型出現的神經癥狀、腦梗死范圍等指標與線栓法致大腦中動脈栓塞模型基本接近。

1.1.4 栓子栓塞阻斷法

通過注入栓子建立腦缺血模型的方法主要有3種：硅膠柱∕硅膠顆粒栓子栓塞阻斷法、月桂酸鈉法、中藥提取物注入法。

1983年，Okada等［24］發現利用硅膠柱栓子注入大腦中動脈主干可栓塞相應血管，形成可靠、重復性好的犬深部腦梗死模型。張放等［25］經頸外動脈向頸內動脈注射硅膠顆粒，硅膠顆粒屬于微栓子，隨血流進入頸內動脈引起腦血管栓塞。此方法可建立基本穩定的腦栓塞動物模型，用于急性腦缺血研究。

尚華等［26］應用月桂酸鈉成功建立兔腦局部缺血模型，其方法是將月桂酸鈉溶液注入兔頸內動脈后造成局部腦缺血。月桂酸鈉導致血栓的原理是，損傷血管內皮細胞，進而引起血小板粘附聚集。應用月桂酸鈉制作局部腦缺血模型能盡量減少腦手術損傷，而且可以避免顱內組織暴露于大氣中，顱內環境穩定性并未遭到破壞。該方法中動物可存活較長時間，便于影像動態觀察，且具有較高的成功率。

有研究者采用中藥白芨及其加工物作為栓塞劑建立大鼠腦缺血模型，其方法為：由頸內動脈注入一定量的白芨微粒懸液或白芨膠，栓子進入頸內動脈-大腦中動脈系統，阻塞大腦中動脈分支及動脈開口［27-28］。白芨富含黏膠類物質白芨膠，白芨膠由甘露糖和葡萄糖聚合而成，無毒、無抗原，具有促進紅細胞積聚、縮短凝血時間及凝血酶原時間的作用，能促進血栓形成［29-30］。研究資料表明白芨膠或白芨微粒是理想的血管栓塞劑［31-32］。

1.1.5 內皮素-1灌注致血管收縮法

張世紅等［33］為大鼠腦內埋置一根套管至大腦中動脈附近，通過套管在動物大腦中動脈附近局部微量注射內皮素-1，也可建立局灶性腦缺血模型。內皮素-1是迄今為止發現的最強的血管收縮因子之一，在體外對血管平滑肌有持久而強的收縮作用。將內皮素-1直接注入活體的腦組織能明顯減少局部血流，導致局部組織損傷，因此可用于大腦中動脈周圍注射誘導局灶性腦缺血。在大腦中動脈周圍注射內皮素-1后，動物可出現明顯的神經癥狀，神經元減少，以及腦水腫和梗死灶。與其他腦缺血模型相比，腦內局部注射內皮素-1可在動物清醒狀態下誘導腦缺血，從而直接觀察缺血后動物的行為改變，同時可避免線栓法對血管內皮的機械性損傷以及麻醉對腦缺血過程的影響。

1.1.6 球囊導管法

Gao等［34］利用自制微球囊導管盲插法建立獼猴大腦中動脈閉塞再灌注模型。為提高穩定性和可重復性，郭云良等［35］經頸總動脈或股動脈介入手術，將標準微球囊導管插入大腦中動脈的起始部，然后充盈微球囊以阻斷大腦中動脈血流，退出微球囊后實現大腦中動脈血流再灌注。此方法易于標準化操作，手術成功率高，重復性好，手術過程無需退出球囊即可通過微球囊導管向大腦中動脈注射微量藥物，為后續治療研究提供了有利條件，且可用于其他大型動物，應用前景好。

1.2 全腦缺血性腦卒中造模方法

1.2.1 2根血管閉塞法

通過大鼠雙側頸總動脈永久性阻斷建立全腦缺血性腦卒中模型，操作簡單，重復性好，常用于慢性全腦缺血研究［36］。其中，長爪沙鼠的大腦動脈環存在不同程度的缺失，夾閉長爪沙鼠頸總動脈即可獲得比大鼠、小鼠更加典型的全腦缺血動物模型［37］。因此，長爪沙鼠全腦缺血模型已成為研究全腦缺血的理想動物模型。

1.2.2 3根血管閉塞法

田鶴邨等［38］采用阻斷基底動脈和兩側頸總動脈的方法造成全腦缺血，阻斷腦主干血管及側支血管血液供應，造成慢性腦供血不足模型。該方法優點是缺血迅速，效果好，可進行血管再灌注，適用于急性全腦缺血性疾病損傷的研究；而缺點是操作過程中會暴露基底動脈，手術創傷大，手術中對周圍組織、神經造成較嚴重牽拉，同時夾閉基底動脈時易損傷延髓。

1.2.3 4根血管閉塞法

1979年Pulsinelli等［39］采用夾閉雙側椎動脈及頸動脈的方法，制作了全腦缺血性腦卒中模型。目前，Pulsinelli四血管法建立的大鼠全腦缺血模型已被廣泛采用。該模型的缺血效果確切，但存在操作復雜、翼突孔難尋找、椎動脈阻斷困難、術中模型動物易出血和死亡等缺點。

1.2.4 心臟驟停法

靖穎霞［40］利用呼氣末夾閉氣管致窒息、3 kg重物壓迫胸部、夾閉心底血管叢3種方法致心臟驟停，引起腦血流中斷。心臟驟停后造成的突然血流中斷對大腦損害嚴重，腦組織缺血缺氧10 s左右即可出現意識喪失，造成全腦缺血性損傷。

1.2.5 頸動脈分流法

花放等［41］通過夾閉大鼠雙側頸總動脈，同時經右頸外動脈持續抽吸頸總動脈內血液，造成大鼠全腦缺血。該方法具有效果可靠、再灌注充分、制備簡便、成功率高，并可經頸動脈注入藥物等優點，適用于全腦缺血再灌注損傷及其干預措施的實驗研究。

2 缺血性腦卒中模型動物的綜合評價

不同動物的缺血性腦卒中模型有各自的優缺點，選擇合適的模型動物對相關研究極其重要。表1列出了不同方法建立缺血性腦卒中模型的動物選擇及評價指標。

表1 缺血性腦卒中模型的動物選擇Table 1 Animal selection of ischemic stroke models

2.1 大鼠

大鼠腦動脈解剖結構接近人類，神經系統較為發達，顱底動脈環結構完整，與人類腦動脈結構差異小，閉塞后累及額頂背外側皮層、尾狀核和蒼白球，部分實驗結果顯示還波及顳區和梨狀區，與人類大腦中動脈主干閉塞后的病理范圍相似。大鼠生命力頑強，抗病力尤其是抗感染能力強，能經受麻醉、外科手術及術后感染的考驗，可實現對神經功能缺陷、藥物療效等長期觀察；而且同系大鼠間遺傳差異小，可保證實驗對象的一致性。因此，大鼠是最常用的缺血性腦卒中模型動物［42］。

2.2 兔

兔腦動脈由頸內動脈和椎動脈兩套血管組成，腦內外循環之間沒有網，與人體解剖情況相似。兔大腦中動脈主干阻斷后，側支循環對大腦中動脈供血區的代償作用很小，有利于建立重復、穩定的腦梗死模型。兔屬于中型動物，相對大型動物如犬、猴等成本低、溫順，對手術具有較強耐受性，術后死亡率低，且術后存活時間較長；同時，可通過耳緣靜脈注射給藥和采血，便于多項生理指標檢測或動態觀察等后期研究進行。此外，兔的頸部血管粗大，可進行再灌注研究。

2.3 小鼠

小鼠價格低廉，來源豐富，繁殖周期短，適應性強，用小鼠建立模型制作方法簡單，生理指標易檢測［43］。但是不同品系小鼠的大腦動脈環解剖結構存在差異，這影響小鼠實驗結果。而且小鼠性別、體質量等對手術結果也存在影響。另外，相對于大鼠及其他動物，小鼠存在手術耐受性差、操作精細度要求高等問題。

2.4 沙鼠

沙鼠以其獨特的腦部構造成為用于篩選腦保護活性成分或腦保護藥物的新興、主流實驗動物。從腦生理結構上講，90%的蒙古沙鼠頸內動脈與椎底動脈的后交通支缺失，大腦基底動脈環（Willis環）不完善。沙鼠腦缺血模型的制作方法簡單，再灌注研究操作方便，近年來在研究腦缺血后腦內各種病理變化機制及藥物腦保護作用中得到廣泛應用，如腦缺血后神經元的凋亡機制、神經元對缺血的耐受性、再灌注損傷、溶栓治療時間窗及藥物保護作用、藥物治療安全性等領域。利用沙鼠制作的單側腦缺血再灌注模型是優秀的病理、生理同體對照的缺血性腦卒中模型。夾閉頸總動脈即可實現短暫性腦缺血模型的制作。與其他動物相比，沙鼠具有體質量較輕、給藥量較少、手術操作簡單、創傷小、成功率高的優勢。然而正是因為其獨特的生理特點，沙鼠模型的適用范圍也較為局限，目前僅用于全腦缺血性腦卒中研究。

2.5 犬

犬為肉食性動物，易于馴養，對手術具有較強耐受性，大腦體積較大，便于手術操作及影像學檢查。而且犬的大腦血管分布與人相似，循環系統和神經系統相對較完善，便于腦血管顯微外科的研究。其缺點是犬的腦血管變異較大，建模時常導致梗死范圍不一致。

2.6 貓

貓屬于多腦回動物，皮層發達，在腦血管分布、血流、代謝等方面比非人靈長類動物更接近于人類。其缺點在于貓腦的大部分血液由頸總動脈供應，而人腦主要由頸內動脈及椎動脈供血，這方面與人腦的差異大。

2.7 豬

豬腦解剖結構與人相近，其灰白質的分布及比例、腦形態學發展和神經系統發育的一系列演變也和人腦相似［44］。豬腦皮質卷積狀及新皮層神經元的總數更接近于靈長類動物。豬腦的體積、大小適合活體動物的誘發電位記錄、神經外科手術的操作及影像學檢測［45-46］。另外，豬對手術的耐受性及抗感染能力較高。

2.8 獼猴、食蟹猴

非人靈長類動物在體位、行為、運動、感覺、新皮質的比例、腦血管的構筑、非骨性腦膜和右手優勢等方面與人類似，而且腦血管和組織對腦缺血的反應最接近人類腦卒中［47-48］。但是由于價格昂貴、不易飼養、來源短缺以及存在倫理爭議等問題，該類動物的廣泛應用受到一定限制。

2.9 其他模型動物

自發性高血壓大鼠是目前國際上公認的比較理想的原發性高血壓動物模型。高血壓是腦卒中的重要危險因素，采用自發性高血壓大鼠建立缺血性腦卒中模型能較好地模擬臨床實際。隨著生物技術研究發展，運用轉基因小鼠可以建立全腦缺血模型和局灶性腦缺血模型，并可用于自由基、炎性細胞因子、興奮性氨基酸受體、載脂蛋白等研究。而且轉基因小鼠模型可通過基因操作方法，將相關基因導入受精卵或著床前的胚胎細胞中，使其在腦內特異性表達，為研究某個基因或相關因素在發病機制中的作用提供了可能。

3 缺血性腦卒中動物模型的綜合評價

理想的動物模型應結合研究者目的，達到研究者預期效果，與所研究的人類疾病在病理和發展過程相似，同時考慮造模周期、成功率、經濟效應等因素［49-51］。合適的缺血性腦卒中動物模型應當符合下列特征：能控制缺血時間、部位、程度；與缺血性腦卒中相關的因素如血壓、血氣、體溫、血糖等可被控制；避免其他疾病對實驗結果產生影響。經過多年發展，目前已建立多種成熟的缺血性腦卒中模型。且隨研究者對實驗動物模型不斷改良，相繼出現了重復性高、病死率低，具有良好應用前景的新型缺血性腦卒中模型。

3.1 局灶性缺血性腦卒中模型

局灶性腦缺血符合臨床上大部分缺血性腦卒中患者的病變類型，其中85%的缺血性腦卒中是由大腦中動脈引起，因此大腦中動脈閉塞模型被普遍認為是局灶性腦缺血的標準動物模型。局灶性缺血性腦卒中動物模型是指通過線栓阻斷、開顱手術、藥物、異物栓塞等外界手段使實驗動物大腦缺血缺氧，從而導致腦卒中。模型動物主要包括大鼠、兔、貓等。動物模型建立時，線栓法是目前公認的局灶性腦缺血模型的標準建立方法，其優點是能夠精確控制再灌注時間，可模擬血管內血栓移除，缺血半暗帶明顯，可避免開顱損傷。隨著研究進步，對于線栓的選擇范圍也在不斷改良優化。線栓法建模的缺點主要是不具備可視性，具有蛛網膜下腔出血風險，不適用于溶栓研究。開顱法也被認為是較經典的造模方法，優點是可視性強，梗死灶形成時間短，通過阻斷大腦中動脈不同部位可對梗死部位和范圍實現一定控制；其缺點是需要開顱，手術損傷大，而且容易造成顱內感染。光化學致血栓形成法的優點是梗死灶定位準確，能保持顱骨完整，且可通過改變熒光照射部位，調整照射光圈大小以及照射時間，從而控制梗死區域及梗死程度；缺點是會引起血管性水腫，血腦屏障破壞，神經功能缺損不明顯，且能自發再灌注。FeCl3致血栓形成法的優點是適用于活體顯微技術，缺點是對重組人組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）敏感性不足，不適用于神經保護性藥物研究。另外，自體血栓阻塞法建立的梗死模型更接近人類缺血性卒中的病理過程，缺點是定位不準確，梗死范圍廣。

3.2 全腦缺血性腦卒中模型

動脈阻斷法（包括2根、3根、4根血管閉塞法）是通過閉塞相關血管，造成大腦缺氧缺血而致全腦缺血；其優點是造模成功率高，指標觀察明確簡單，可根據實驗需要確定阻斷血管時間長短以控制腦缺血程度，適用于血管再灌注；缺點是手術難度大且對周圍組織牽拉嚴重，恢復血流時會受影響。其中，4根血管閉塞法因其高度模擬人類急性缺血性變化，缺血后生理指標穩定，病理改變充分，因此被認為是至今為止最理想的全腦缺血動物模型的建立方法；其缺點是動物存活率相對低，模型制作有難度，有時分離不足，視野受限。大鼠、沙鼠、家兔因其生理特性，是目前全腦缺血性腦卒中動物模型建立時最常選用的實驗動物。

4 展望

人類缺血性腦卒中的發病機制及病理生理學過程尚未明確，臨床上對于缺血性腦卒中仍缺乏有效的治療措施。腦缺血動物模型的局限性仍是基礎研究難以實現向臨床轉化的主要原因。目前絕大多數腦缺血動物模型僅僅只能模擬缺血性腦卒中機制的一個或幾個方面，尚沒有普遍適用的腦缺血動物模型。本文對各種缺血性腦卒中動物模型的制作方法及其優缺點進行了分析闡述，研究者可根據不同實驗目的選擇相應的實驗動物模型。如何對缺血性腦卒中動物模型進行改進，使其與臨床情況更吻合，仍是目前醫學科研工作者需要解決的難題。需要明確模型動物和人類的種屬差異，通過了解不同腦缺血模型的優勢與不足，選擇適合自己研究方向的動物模型，并在科學技術更新的同時不斷對模型進行改良，更好地實現對并發癥的模擬以及對生理學影響因素的控制。因此，探索出更接近人類卒中發病過程的動物模型迫在眉睫，這可能會進一步加深人們對于缺血性腦卒中病理機制的認識，開發出利于轉化的藥物，為缺血性腦卒中的治療開辟新的道路。

[作者貢獻]

董波：提出論文思路，設計論文內容，負責論文撰寫；

劉嘉欣：提供論文材料及整理文獻資料；

熊偉：參與選題與設計，資料分析；

唐宋琪：提供研究方案，修訂論文；

黃巍：終審論文，指導性支持。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。