繼發(fā)性淋巴水腫動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

楊 杏,潘興芳,2,趙天易,趙美丹,2,李忠正,2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究中心,天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,天津 301617;3.中國中科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700)

繼發(fā)性淋巴水腫（secondary lymphedema，SL）是由于癌癥、放射治療、慢性靜脈功能不全、手術(shù)、外傷或感染所導(dǎo)致的淋巴系統(tǒng)阻塞或破壞引起的疾病［1-2］。SL的發(fā)病原因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此治療手段局限，無法有效治愈［3］。其中，手術(shù)和放射治療是SL最常見的原因。繼發(fā)于手術(shù)及放射治療的淋巴水腫可能是在淋巴系統(tǒng)損傷后，富含大量蛋白質(zhì)的淋巴液由于回流受阻滯留于組織間隙，導(dǎo)致組織間隙的膠體滲透壓升高、血管內(nèi)外滲透壓差減小，使得大量液體從毛細(xì)血管進(jìn)入組織間隙，從而形成高蛋白性水腫。而淋巴液中蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)一步刺激結(jié)締組織異常增生，出現(xiàn)膠原沉積，導(dǎo)致皮下組織逐漸纖維化，加重淋巴水腫程度［4-5］。盡管針對SL的研究不斷深入，但該疾病動(dòng)物模型復(fù)雜多樣，缺乏規(guī)范性，限制了其病理機(jī)制的深入探討。創(chuàng)建穩(wěn)定的能較好模擬臨床特征的繼發(fā)性淋巴水腫動(dòng)物模型是目前亟待解決的問題。

SL模型最早見于19世紀(jì)［6］，是以犬類為模型動(dòng)物，由于技術(shù)條件的限制，多產(chǎn)生急性淋巴水腫，難以形成慢性繼發(fā)性淋巴水腫。隨后，研究人員又建立了幾種不同動(dòng)物的SL模型，包括大鼠、小鼠、兔、猴等。目前，手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合是建立SL模型較常用的方法，但不同動(dòng)物的放射劑量和放射時(shí)機(jī)會有差異，且操作部位常有不同，如嚙齒類動(dòng)物常用后肢和尾部，兔類動(dòng)物常用耳朵和后肢部位，犬和猴類常用后肢。

本文從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類和造模干預(yù)方法兩方面，對2000年至今發(fā)表的SL動(dòng)物模型相關(guān)的主要研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 常用于構(gòu)建繼發(fā)性淋巴水腫模型的動(dòng)物

1.1 嚙齒類

嚙齒類動(dòng)物是常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。嚙齒類動(dòng)物與人類基因水平高度同源，其免疫力及對外界環(huán)境的適應(yīng)力強(qiáng)，存活率高［7］，且價(jià)格低廉，易繁殖。研究人員常在嚙齒類動(dòng)物的后肢［8-10］和尾部［11-12］進(jìn)行造模。也有學(xué)者認(rèn)為，大鼠因淋巴結(jié)構(gòu)分明而常被用于SL實(shí)驗(yàn)，適用于研究人類SL［13］。

1.2 犬

犬的淋巴系統(tǒng)在淋巴管的數(shù)量、大小和深淺層次排列分布方面，與人類淋巴系統(tǒng)有著顯著的相似性［14］。犬類動(dòng)物體型較大，后肢血管和淋巴管口徑較粗，因而其器官與組織方便后期實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的觀察與統(tǒng)計(jì)，尤其適用于顯微淋巴外科的應(yīng)用及研究。目前，多使用犬類四肢進(jìn)行造模［15］。

1.3 兔

兔的淋巴系統(tǒng)可以分為耳前、下頜下、側(cè)頸根、腋窩、腰椎、腹股溝、尾根和腘區(qū)這8個(gè)區(qū)域［16］，每個(gè)區(qū)域都分布各自的淋巴管和淋巴結(jié)。目前，常用兔類在耳部制備SL動(dòng)物模型。同時(shí)，兔也常被用于研究淋巴結(jié)移植等方面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)［17］。

1.4 豬

豬的淋巴系統(tǒng)包含7個(gè)淋巴體：腮腺、下頜、頸背、頸腹側(cè)、髂下、腹股溝和腘區(qū)。由于淺表腋窩區(qū)域不存在淋巴結(jié)，因此豬不適用于建立乳腺癌相關(guān)SL模型［18］。

2 常用的建模方法

在建立SL動(dòng)物模型過程中有許多不同的造模方式，主要有單純手術(shù)、手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合這兩種方法。目前為止，尚沒有完善的SL動(dòng)物模型。本文分析已有文獻(xiàn)并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，以便于之后開展相關(guān)研究。

2.1 手術(shù)方法

單純通過手術(shù)建立SL動(dòng)物模型的方法主要是破壞淋巴結(jié)和淋巴管。下面基于動(dòng)物種類進(jìn)行分類敘述（表1）。

表1 通過手術(shù)干預(yù)建立的常見SL模型Table 1 Common secondary lymphedema model established by surgical intervention

2.1.1 鼠的手術(shù)造模方法

鼠類最常用尾部操作。鼠尾部SL模型涉及所有真皮水平初始淋巴管的圓周結(jié)扎，手術(shù)方法簡便，成模率高。該方法將鼠尾部近端皮膚通過圓周切口切開，并對染色的集合淋巴管進(jìn)行燒灼以破壞尾部淋巴管，但這種方式可能會導(dǎo)致尾部壞死和早期的尾部腫脹消退［11］。研究證實(shí)，鼠尾部術(shù)后損傷的淋巴管生長和重塑為SL的生物學(xué)研究提供了穩(wěn)定有效的基礎(chǔ)［19-21］。但是不同于人類肢體，鼠尾大部分是由表皮和軟骨構(gòu)成［22］，因而鼠尾部SL模型可能與人類肢體淋巴水腫無相似性。這一點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

2.1.2 兔的手術(shù)造模方法

使用兔耳構(gòu)建SL模型也是常用方法。將兔耳全皮膚剝脫和破壞淋巴通道后，約15 d后出現(xiàn)腫脹。這種造模方式耗時(shí)短，易復(fù)制。兔耳部SL模型是研究淋巴水腫治療新方法的可重復(fù)替代方案［23］。

2.1.3 大型動(dòng)物的手術(shù)造模方法

大型動(dòng)物SL模型與人類疾病模式具有較大的相似性，且淋巴引流系統(tǒng)單一，較為清晰。在這類模型中，清掃四肢淋巴結(jié)是誘導(dǎo)淋巴水腫的主要方式。Tobbia等［24］采用綿羊作為實(shí)驗(yàn)對象，通過手術(shù)縫合淋巴管，并切除單個(gè)腘淋巴結(jié)；但是在淋巴結(jié)切除后的12～16周，大約有80%的綿羊淋巴功能得以恢復(fù)，難以形成慢性SL。這說明單純通過手術(shù)的方法切除綿羊腘窩淋巴結(jié)后，會出現(xiàn)淋巴管再生的情況，影響模型的制備。Olszewski等［25］通過切除犬后肢上部皮膚、皮下組織、筋膜和股骨骨膜，并橫斷主要的淋巴管來實(shí)現(xiàn)淋巴水腫。盡管犬較綿羊切除了更多的組織，但是最終僅有三分之一的犬發(fā)生慢性SL。

綜上，雖然通過手術(shù)方法進(jìn)行SL模型制備十分常見，但是研究發(fā)現(xiàn)僅通過手術(shù)切除淋巴管后制備的動(dòng)物模型，傷口范圍大、創(chuàng)傷深所導(dǎo)致的炎性反應(yīng)會使周圍組織釋放促淋巴管新生因子，如血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C），激活干細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞，使其分化增殖，進(jìn)而促進(jìn)淋巴管新生，這一過程會對SL動(dòng)物模型的制備產(chǎn)生影響［26］。另外，手術(shù)方法的差異性會導(dǎo)致水腫高峰出現(xiàn)時(shí)間不一致，且多產(chǎn)生急性SL，難以持續(xù)。因此，單純通過手術(shù)方法進(jìn)行造模時(shí)需要克服一些關(guān)鍵問題，如SL生成的不確定性、高并發(fā)癥發(fā)生率、缺少誘導(dǎo)淋巴水腫的診斷標(biāo)準(zhǔn)等［27］。

2.2 手術(shù)與放射相結(jié)合

在臨床中，SL的發(fā)生多數(shù)是癌癥手術(shù)放化療后損傷淋巴系統(tǒng)所致［2］。為了更好地模擬臨床手術(shù)與放射治療相結(jié)合的情況，淋巴清掃術(shù)后聯(lián)合放射技術(shù)破壞術(shù)后殘余淋巴管以抑制淋巴再生和側(cè)支循環(huán)，這種方法更能構(gòu)建符合人類SL的狀態(tài)。但是這種建模方式不僅需要選擇合適的放射時(shí)機(jī)，而且需要考慮放射劑量的問題。對此，研究人員進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，但是不同的動(dòng)物可以采取的最佳放射劑量仍需要繼續(xù)摸索、驗(yàn)證。

現(xiàn)筆者從動(dòng)物種類、放射時(shí)機(jī)及放射劑量等方面進(jìn)行論述，總結(jié)文獻(xiàn)中常見的手術(shù)與放射結(jié)合SL模型，見表2。

表2 通過手術(shù)與放射結(jié)合建立的常見SL模型Table 2 Common secondary lymphedema model established by surgery combined with radiation

2.2.1 放射時(shí)機(jī)

在手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合的方法中，動(dòng)物的四肢是最常采用的部位，其中放射的時(shí)機(jī)和劑量十分重要。在放射時(shí)機(jī)方面，Das等［28］以犬后肢作為模型基礎(chǔ)，在腹股溝進(jìn)行結(jié)締組織、肌肉筋膜和深部淋巴管切除后，將犬分為兩組，在相同放射劑量的情況下，分別進(jìn)行術(shù)前放射和術(shù)后放射。結(jié)果顯示，術(shù)前放射組在術(shù)后4～6周所有存活的犬均發(fā)展出SL，并持續(xù)至少12個(gè)月，而術(shù)后放射組結(jié)果不甚理想。研究人員認(rèn)為，術(shù)前放射更容易破壞真皮淋巴結(jié)，構(gòu)建的淋巴水腫動(dòng)物模型更為持久且成功率較高，因此術(shù)前放射組優(yōu)于術(shù)后放射組。但也有學(xué)者認(rèn)為，術(shù)前放射或術(shù)后放射均對SL模型的制備沒有影響。孫一宇等［29］通過調(diào)整手術(shù)時(shí)機(jī)，將小鼠隨機(jī)分為3組：術(shù)前放療組、術(shù)后放射組、術(shù)前及術(shù)后放射組。結(jié)果顯示，這3組均成功構(gòu)建了小鼠后肢SL模型，但以術(shù)前及術(shù)后放射組效果更優(yōu)，SL持久，同時(shí)小鼠死亡和發(fā)生SL并發(fā)癥的概率較低。以上三組均選擇術(shù)前3 d和術(shù)后2周放射，劑量為4.5 Gy。綜上所述，以手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合的方式建立SL模型時(shí)，放射時(shí)機(jī)上存在爭議，可能術(shù)前及術(shù)后聯(lián)合放射的方式更合適。

2.2.1 放射劑量

在放射劑量方面，根據(jù)動(dòng)物種類的差異性，所適用的放射劑量也不同。

目前采用手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合的方法制備SL模型時(shí)最常用的是嚙齒類動(dòng)物。有研究者通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同的放射劑量對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響差異性較大。Sommer等［21］嘗試在12只雌性大鼠的后肢誘導(dǎo)SL：手術(shù)切除大鼠右后肢的腹股溝淺淋巴結(jié)、腘窩淋巴結(jié)和鄰近淋巴管，術(shù)后7 d在右腹股溝施以單劑量15 Gy的放射，放射后4周處死動(dòng)物。經(jīng)過磁共振成像技術(shù)觀察水腫程度，除去在磁共振成像采集過程中因擺放位置不可觀察的4只大鼠外，剩余大鼠中有87%成功構(gòu)建了SL模型。Yang等［30］將雄性大鼠分為4組，在術(shù)后分別施以20、30、40 Gy劑量的放射，其中接受20 Gy放射劑量的大鼠建模成功率為81.5%，放射劑量在30～40 Gy的大鼠建模成功率約37%～50%，同時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥和較高的死亡率；通過選擇合適的手術(shù)部位并結(jié)合適當(dāng)?shù)姆派鋭┝浚洚a(chǎn)生的下肢淋巴水腫可以長達(dá)4個(gè)月。大鼠較為合適的放射劑量約為25～35 Gy，這樣制備的SL動(dòng)物模型并發(fā)癥少，死亡率低，水腫持續(xù)時(shí)間長。J?rgensen等［31］在研究雄性小鼠后肢SL的實(shí)驗(yàn)中，將小鼠后肢皮膚環(huán)狀切開，切除淋巴結(jié)并結(jié)扎淋巴管，然后分別在術(shù)前7 d及術(shù)后3 d施以7.5、10、15和30 Gy不同劑量的放射。結(jié)果顯示，低劑量放射小鼠在術(shù)后出現(xiàn)急性期水腫，但未持續(xù)；而較高劑量放射雖可誘發(fā)持續(xù)的SL，但容易出現(xiàn)并發(fā)癥；術(shù)前、術(shù)后10 Gy組的小鼠在1周后逐漸成功地誘導(dǎo)出SL，并且未出現(xiàn)嚴(yán)重的肢端壞死等并發(fā)癥。最后建議用小鼠建立SL模型時(shí)適合的放射劑量約為4.5～10 Gy。另外，由于制備方式簡便，鼠尾部常用于創(chuàng)建SL動(dòng)物模型，但是鼠尾部可能不適用于制備慢性SL動(dòng)物模型。

基于兔類后肢的SL造模相對較少。柴凡等［32］將雄性日本大白兔分為手術(shù)組、放射組及聯(lián)合組。手術(shù)組切除右側(cè)腋窩、胸肌外緣及鎖骨下淋巴結(jié)，并結(jié)扎破壞全部可見淋巴管；放射組取劑量15 Gy的γ射線進(jìn)行照射；聯(lián)合組則是以同樣的手術(shù)方式結(jié)合術(shù)后7 d以相同的劑量放射。最終放射組不能成功構(gòu)建模型，而手術(shù)組建模成功率約75%，聯(lián)合組的成功率達(dá)100%。侯傳強(qiáng)等［33］應(yīng)用手術(shù)聯(lián)合術(shù)后一次性大劑量射線照射的方法，于兔后肢做環(huán)形切口并切除皮膚、皮下組織達(dá)肌肉，清掃腹股溝區(qū)淋巴結(jié)，鏡下分離與股部血管和神經(jīng)伴行的深部淋巴管并將兩端結(jié)扎，術(shù)后3 d給予20 Gy劑量照射手術(shù)野。3個(gè)月后兔開始出現(xiàn)漸進(jìn)性的肢體水腫，約5個(gè)月形成穩(wěn)定的兔后肢慢性SL模型。手術(shù)聯(lián)合術(shù)后一次性大劑量放射的造模方式成功率約為83%，但一次性大劑量（20 Gy）放射容易導(dǎo)致肢端壞死等并發(fā)癥，因此兔類后肢使用的放射劑量建議在15～20 Gy較合適。另外，在相同劑量的情況下，還應(yīng)該進(jìn)一步研究單次放射與分批次放射的效果。

吳國君［34］使用健康雌性獼猴模擬實(shí)施人類腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)。分別于術(shù)前2周及術(shù)后4周聯(lián)合使用放射技術(shù)對動(dòng)物腋窩區(qū)域進(jìn)行放射以破壞殘存的淋巴管，放射劑量為30 Gy，成功誘導(dǎo)獼猴上肢產(chǎn)生SL，并持續(xù)存在24個(gè)月。雖然獼猴等靈長類動(dòng)物與人類生理、解剖和遺傳等因素極其相近，但是由于成本較高，目前尚缺少大樣本研究，且使用猴類的SL相關(guān)研究較少。

綜上，放射劑量的高低對模型的成功制備十分重要，劑量過高容易導(dǎo)致許多不可預(yù)估的并發(fā)癥，如肢端壞死等，而劑量過低則達(dá)不到抑制淋巴再生和側(cè)支循環(huán)的效果。在大鼠后肢構(gòu)建SL模型較為常見，制備方式簡便，技術(shù)比較成熟，成功率較高。

3 總結(jié)及展望

目前臨床上尚無能治愈SL的有效方法，其治療效果不佳的主要原因是SL發(fā)病機(jī)制研究不清。建立規(guī)范可靠的動(dòng)物模型可有力地推動(dòng)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。本文從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、造模干預(yù)方法等方面對目前已有的SL動(dòng)物模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在嚙齒類、犬、兔、豬等常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，嚙齒類是最常用的動(dòng)物模型。其中，建立大鼠SL模型常采用手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合的方法，放射總劑量為25～35 Gy。由于放射干預(yù)3 d后，淋巴組織開始損傷，術(shù)后2周殘余的淋巴管新生，因此在術(shù)前3 d和術(shù)后2周進(jìn)行放射是破壞淋巴系統(tǒng)較佳的放射時(shí)機(jī)［35］。大鼠后肢SL動(dòng)物模型的構(gòu)建成功率高，效果持久且并發(fā)癥較少。小鼠常通過手術(shù)方法進(jìn)行尾部環(huán)切以建立SL動(dòng)物模型，但是小鼠尾SL模型與人類淋巴水腫的差異較大，使其應(yīng)用受到了一定限制。兔類SL模型同樣適用于研究人類淋巴水腫相關(guān)性疾病，常采用耳部和四肢進(jìn)行造模；但由于兔耳部與人類淋巴水腫部位在解剖學(xué)上存在差異，因此兔耳部SL模型也具有一定的缺陷。而且兔相較于嚙齒類動(dòng)物價(jià)格昂貴，從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，目前較少使用。另外，依據(jù)目前的造模方法分析，單純的手術(shù)方法雖然可以成功制備急性SL動(dòng)物模型，但是需嚴(yán)謹(jǐn)分析手術(shù)部位及切除部分。而手術(shù)與放射技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行SL建模是目前常用的方法，通過手術(shù)破壞淋巴結(jié)和淋巴管，聯(lián)合放射技術(shù)破壞殘余淋巴管，并抑制手術(shù)后可能發(fā)生的自發(fā)性淋巴管再生。然而采用手術(shù)及放射技術(shù)聯(lián)合的方式耗費(fèi)時(shí)間過長，在價(jià)格方面也相對昂貴。

目前在制備SL動(dòng)物模型的過程中，還存在一些缺陷，例如：測量腫脹程度的方法，目前主要是排水法和軟尺測量法，均存在主觀性；關(guān)于大鼠后肢SL模型的報(bào)告較多，而前肢造模無報(bào)告。在臨床上，乳腺癌是造成上肢淋巴水腫的主要原因之一，患者在完成乳腺癌淋巴清掃術(shù)和放射治療后，多數(shù)患者會出現(xiàn)上肢SL。因此，為了能更好地模擬臨床上肢SL的狀態(tài)，筆者認(rèn)為，建立大鼠前肢SL模型對于乳腺癌相關(guān)淋巴水腫的研究可能具有重要價(jià)值和意義。

[作者貢獻(xiàn)]

楊杏：提出文章思路，撰寫并修改文章；

潘興芳：對文章思路有重要建議，檢查文章中語句詞匯并最終定稿；

趙天易：文章框架修改，對文章的思路有重要建議；

趙美丹：文章框架及內(nèi)容修改；

李忠正：參與論文章修改。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。